מוקד Macropatch הקלטות של זרמי סינפטית מצומת דרוזופילה Neuromuscular זחל

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לנטר את הפעילות הסינפטית של בוטונים סינפטיים חזותיים בצומת העצב-שרירי של זחל הדרוזופילה. מערכת מודל מצוינת הניתנת לתיקון בקלות למניפולציות גנטיות. טכניקה זו יכולה לענות על שאלות מפתח במדע שלך.

כגון כיצד מוטציות של חלבונים סינפטיים מווסתות את ההעברה הסינפטית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנטר את פעילותם של מספר מצומצם של אתרי שחרור ולתעד זרמים של קינטיקה מהירה וניתן לפתור אותה בקלות. כדי להתחיל בניסוי: הכן את חולץ המיקרואלקטרודה.

השתמש במיקרוסקופ בהגדלה של פי 35 כדי להבטיח שהקוטר הפנימי של האלקטרודה הנמשכת יהיה בטווח של שבעה עד עשרה מיקרומטרים. אחסן את הנימים במיכלים סגורים היטב כדי למנוע הצטברות אבק. לאחר מכן, אש נימים מלוטשים באמצעות מיקרו זיוף.

ודא שהקוטר הפנימי הסופי של האלקטרודה המלוטשת הוא חמישה מיקרומטרים. לאחר מכן, עברו לכיפוף. תקן את האלקטרודה במניפולטור ומקם את הקצה מעל החוט ולא נוגע בו.

הגדר את ערך החום ל-60-70% מהמקסימום ולחץ על דוושת המיקרו פורג' למשך שנייה עד שתיים כדי לחמם את הנימה. השתמש במחט בצורת L כדי למשוך בעדינות את קצה האלקטרודה כלפי מטה ולבצע את העיקול בכ-90 מעלות. החזק את האלקטרודה מעל להבת הלפיד ביד ובצע את העיקול השני בשבעה עד עשרה מילימטרים מהעיקול הראשון ובזווית של כ -120 מעלות.

הכן תמיסה דמוית המולימפה, או HL3. שמור את התמיסה במסנן והפוך אותה לטרייה מדי שבוע. הכן פיפטות גירוי באותו אופן כמו הקלטת פיפטות זכוכית מבלי לכופף אותן.

לאחר מכן, הכניסו פיפטת גירוי למחזיק מיקרואלקטרודה המחובר למזרק. צלחות חיתוך מיוצרות מצלחות פטרי קטנות המצופות באפוקסי גומי סיליקון. לאחר מכן, בעזרת מלקחיים בחרו זחלי כוכב שלישי נודדים מבקבוקון.

הצמד את הזחלים והניח את הסיכה הראשונה בחלק האחורי וסיכה נוספת קדמית קרוב לווים בפה. הוסף פתרון HL3. בצד הגבי של הזחלים בצע חתך בעזרת מספריים קפיציים מהסיכה העליונה לסיכה התחתונה.

הצמד את פילה הזחלים והניח שני סיכות נוספות בצד שמאל וימין של הזחלים. הסר את המעיים וקנה הנשימה באמצעות מלקחיים. חותכים את העצבים ממש מחוץ לחוט העצב הגחוני באמצעות מספריים קפיציים.

מניחים את צלחת הפטרי עם התכשיר על במת המיקרוסקופ. הכנס את אלקטרודת הייחוס לאמבטיה. מלאו את אלקטרודת ההקלטה בתמיסת HL3.

תחת המטרה 10X טבלו את האלקטרודה באמבטיה והניחו אותה על שרירים 6 ו-7 מהפרעות הבטן של שתיים, שלוש או ארבע באמצעות המניפולטור המיקרו. לאחר מכן, העבר את המטרה ל-60X והתמקד באזור העניין באמצעות אופטיקה אפי-פלורסנציה או DIC. הנח את קצה האלקטרודה על גבי הזרוע הסינפטית ולאחר מכן לחץ את האלקטרודה בעדינות רבה על השריר מכיוון שלחץ מוגזם עלול לפגוע ב- NMJ או לגרום לעלייה בפעילות הסינפטית הספונטנית.

לאחר מכן, הפעל את המגבר, לוח AD והמחשב. לאחר מכן, בחר את מצב מהדק המתח במגבר. הפעל את תוכנת הרכישה ובחר במצב נטול פערים וצפה במראה של MEJCs על מסך המחשב.

ודא שהמשרעת של ה-MEJCs היא בטווח של 0.2 עד 0.7 ננו-אמפר. באמצעות מיקרו מניפולטור תחת בקרה חזותית, מקם את אלקטרודת הגירוי ליד האקסון המעצבב מקטעי בטן שניים עד ארבע. הפעל לחץ שלילי על ידי משיכת הבוכנה של המזרק המחובר למחזיק האלקטרודה כך שהאקסון נמשך בתוך האלקטרודה.

לאחר מכן, הפעל את הממריץ. סובב את הכפתור ביחידת הבידוד כדי להגדיר זרם אפס ולאחר מכן הגדל אותו בעדינות עד להופעת ה-EJC או עד להגעה לסף. בצע את הגירוי במשטר סף על.

עם הגירוי זרם הגירוי גדל בערך פי שניים בהשוואה לסף התצפית על EJC. מדוד את התנגדות האיטום של אלקטרודת תיקון המאקרו על ידי סיבוב מתג התנגדות האלקטרודה של המגבר למצב בדיקת האיטום. שימו לב לערך התנגדות האיטום בג'יגה אוהם שיוצג בחלון הנוכחי.

הקלטות מדבקות מאקרו מוקדיות מאפשרות ניטור פעילות סינפטית מבוטונים סינפטיים נבחרים. כאשר האלקטרודה ממוקמת על גבי בוטון סינפטי, ל-MEJCs המוקלטים יש אמפליטודות העולות באופן משמעותי על רמת הרעש ושלבים עולים חדים בטווח של תת-אלפית השנייה. כאשר אלקטרודת ההקלטה מתרחקת מהבוטון הסינפטי בכמה מיקרונים, משרעות ה-MEJC של המקליט יורדות כמעט לרמת הרעש.

בקושי ניתן להבחין בין ה-EJCs המוקלטים לבין הרעש ויש להם שלבי עלייה ממושכים. הקלטות מוקד מאפשרות זיהוי מדויק של MEJCs במוטציה המורכבת והגמדים. בעוד שההקלטות הבין-תאיות ממוטציה זו מציגות אירועים חופפים ולא ניתן לזהות אותם באופן מהימן.

התאמת הזוויות של שבב האלקטרו היא קריטית למיקום האלקטרודה. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כמו בדיקת הדמיה של אירועי שחרור בודדים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו שילוב הפעילות של אזורים פעילים בודדים.