默克尔细胞多瘤病毒感染与检测

我们提出了默克尔细胞多母病毒感染的第一个细胞培养模型。该协议包括皮肤成纤维细胞的分离、MCPyV病毒感染的准备、免疫荧光染色和荧光原位杂交。该协议使得研究MCPyV感染周期和与宿主细胞的相互作用成为可能，同时避免了与病毒基因过度表达相关的伪影。

首先，用一把剪刀修剪人类新生儿包皮的脂肪和皮下组织。将皮肤样本切成两半或四分之四。将组织放在5毫升10毫克每毫升非基II NPBS，辅以抗生素抗霉菌。

一夜之间在4摄氏度下孵育。第二天，使用微切除钳子在10厘米的培养皿中小心地将表皮从皮肤层分离。将所得皮肤组织转移到含有每毫升2毫克的15毫升锥形管，不含FBS的介质中含有2毫克的胶原酶IV型，并辅以抗生素-抗原体。

在37摄氏度的2氧化碳中孵育样品，定期摇晃4至6个小时，直到只保留几个宏观组织聚集体。在此之后，使用10毫升移液器将样品溶液上下大力移液10次，从真皮中释放单个细胞。在180克下离心5分钟，然后丢弃上一代。

在补充的DMEM介质中镀块分离的细胞。在下午晚些时候或傍晚，将600万293TT28细胞种子放入含有补充DMEM培养基的10厘米培养皿中。在37摄氏度下孵育，二氧化碳含量为5%。

第二天早上，确保细胞约50%的汇合，然后用66微升转染试剂转染细胞，12微克重合MPyV分离R17B DNA，8.4微克ST表达质粒pMtB，9.6微克LT表达质粒PADL。用5%的二氧化碳在37摄氏度下孵育细胞过夜。第二天，当转染细胞几乎汇合时，三叶草使细胞分裂，并转移到15厘米的培养皿中继续扩张。

当该盘几乎汇合时，将细胞转移到三个新的15厘米的盘子中。当这些新菜几乎汇合时，收获文本协议中概述的细胞。在室温下180克离心5分钟。

然后去除上一除以，并加入一个细胞体积的DPBS镁。加入25微摩尔硫酸铵，其次是0.5%Triton X-100，0.1%苯子酶，和0.1%的ATP依赖DNAse。混合好，在37摄氏度过夜孵育。

第二天，在冰上冷却混合物15分钟。接下来，加入0.17体积的氯化钠。在冰上混合和孵育15分钟。

在4摄氏度下在12000克下离心10分钟。如果上清液不清楚，轻轻反转管子并重复离心。在此之后，将上经器转移到新管中。

将颗粒重新在 1 体积的 DPBS 中补充 0.8 摩尔氯化钠。在4摄氏度下在12000克下离心10分钟。如果上清液不清楚，轻轻反转管子并重复离心。

将两种超级natant将和在4摄氏度下12000g再次离心10分钟。然后，使用移液器将碘异醇的梯度沉积到薄壁五毫升多聚体管中，如文本协议中所述。在准备好的碘黄醇梯度上加载3毫升的澄清性病毒的上清液。

在 234000 g 和 16 摄氏度下使用 SW 55 Ti 转子的离心机，可保持 3.5 小时，确保将加速和减速设置为减速。超离心完成后，收集硅化管中的12个分数。维护和分离细胞后，在10毫升的补充DMEM和F12培养皿。

将细胞溶液转移到15毫升管中。在180克时离心两分钟。丢弃上一提液，以每毫升2万至4万个细胞的细胞密度重新悬浮补充DMEM和F12培养基中的细胞。

然后，种子200或400微升的细胞悬浮液补充1毫克每毫升胶原酶IV型到每井24或96井板，分别。从零下 80 摄氏度的冰柜中取出 MCPyV viron 库存，放在冰上解冻。每2500至5000个细胞每添加10亿个相当于MCPyV病毒的HIV基因。

轻轻敲击板的一侧，在37摄氏度下孵育5%的二氧化碳。首先，在PBS中用4%PFA将细胞固定在盖滑上10分钟，然后用PBS洗涤盖滑两次，并在4摄氏度下用70%乙醇在四摄氏度下过夜，使细胞渗透。第二天，用探针水化缓冲液代替乙醇，在室温下孵育60分钟，使样品预杂交。

在杂交前孵化结束前30分钟，在1:500稀释时稀释探针杂交溶液中的探针，并在45摄氏度下孵育。当孵育完成时，移液器上稀释探针混合物的大约10微升，用于每个盖滑的显微镜幻灯片。将每个盖滑单元侧向下放在其各自的杂交混合液滴上。

使用自由量的橡胶水泥，密封每个盖的边缘和背面滑到其幻灯片。将幻灯片放在热块的平侧，加热至 94 摄氏度三分钟。之后，将滑梯转移到加湿室，并在45摄氏度下孵育。

第二天，用钳子小心地剥去橡胶水泥。将盖板将细胞侧滑入 24 孔板的孔中，并在室温下用探头洗涤缓冲液清洗三次。在每个含盖滑的井中加入200微升扩增缓冲液，并在室温下孵育30至60分钟。

同时，将两个标有寡核苷酸发夹的退火每个发夹在单独的PCR管中识别探针，加热到94摄氏度90秒，然后冷却到室温30分钟。在1:50的稀释下，将发夹混合在放大缓冲液中。接下来，将石蜡膜拉伸到12井板盖的打开面上，使表面发生放大反应。

将发夹混合物的 50-100 微升液滴到每个盖滑的石蜡薄膜上。使用钳子，小心地从预放大溶液中去除每个盖滑，然后触摸边缘，使多孔的一次性擦拭干燥。将每个干燥的盖滑电池侧向下放置到放大液滴上。

将板盖转移到加湿室中，在室温和黑暗中孵育过夜。第二天，将盖滑回24孔板的井中。将含有DAPI的5X SSCT加入到每毫升0.5微克的浓度中，并在室温下孵育一小时。

在此之后，在室温下用 5X SSCT 清洗样品两次。将洗涤盖滑到显微镜幻灯片上，并使用倒置荧光显微镜分析细胞并成像样品。在这项研究中，一个几乎同质的人类皮肤成纤维细胞种群被隔离。

免疫荧光染色表明，近100%的分离人类皮肤细胞被正面染色为皮肤纤维细胞标记物、维门丁和胶原蛋白，但人体外皮角细胞标记K14呈阴性。然后生成 MCPyV 病毒，并在可视化集中在梯度核心的 MCPyV 病毒带后，收集 500 微升分数，并执行 MCPyV qPCR 以识别峰值分数。此处显示了感染 MCPyV 的 HDF 的免疫荧光染色图像，其中 LT 阳性、VP1 阳性或 LT 和 VP1 阳性的细胞均被视为 MCPyV 感染阳性。

超过 30% 的细胞为 LT 阳性，超过 10% 的细胞为 VP1 阳性。在受感染细胞中复制的MCPyV基因组使用HCR-DNA鱼和免疫荧光-HCR-DNA鱼检测。虽然 HCR-DNA FISH 揭示了复制工厂中存在的 MCPyV DNA 的定位，但免疫荧光-HCR-DNA FISH 方法允许在复制中心同时检测 MCPyV DNA 和 LT 蛋白的共定位。

为了达到最佳的病毒感染效率，MCPyV集中在每微升至少2×10至8个病毒基因组中非常重要，因为碘氧醇对细胞有毒。在皮肤纤维细胞的MCPyV感染之后，可以进行许多分子生物分析，包括免疫荧光、免疫阻断、免疫位化和基于qPCR的测定。我们描述的感染系统使研究人员有可能研究MCPyV感染的阶段，如核贩运和病毒包装。

MCPyV 是一种 BSL-2 病毒，但在实验室环境中达到的量中，其病理学潜力却很少为人所知。因此，研究人员应采取预防措施，避免接触病毒。