Ensayo de ATAC-seq con ADN mitocondrial baja contaminación primaria humana CD4 + linfocitos T

Este protocolo ATAC-seq modificado introduce un nuevo búfer de lesis que disminuye las lecturas mitocondriales contaminantes de 50% a menos de 3%La disminución de la contaminación mitocondrial permitirá a los investigadores realizar un ATAC-seq más eficiente con una disminución del 50% en los costos de secuenciación. Hemos validado este nuevo protocolo ATAC-seq en PBMC primario humano, monocitos primarios humanos, células dendríticas de ratón y líneas celulares de melanoma. Creemos que será eficaz en una amplia gama de tipos de células.

Minimizar la pérdida de muestra durante el proceso de activación y selección de celdas es fundamental para obtener resultados de alta calidad con ATAC-seq. Demostraremos cómo manejar un pequeño número de células a partir de muestras preciosas utilizando equipos básicos de laboratorio. Para empezar, descongele un vial de células CD4+T previamente aisladas en un baño de agua Celsius de 37 grados hasta que el hielo se haya derretido.

Luego transfiera suavemente las células a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga nueve mililitros de RPMI completa precale calentada. Centrifugar las células a 1.500 veces G, y cuatro grados Celsius, durante seis minutos. A continuación, deseche el sobrenadante y resuspender suavemente el pellet en dos mililitros de RPMI completo.

Después de repetir la centrifugación, deseche el sobrenadante y resuspender suavemente las células en 0,5 mililitros de RPMI completa. Usa un hemocitoómetro para contar las células. Usando RPMI completo, ajuste la densidad de la suspensión celular a la placa 50,000 CD4+células en 200 microlitros por pozo de una placa de fondo redondo de 96 pozos.

Luego, para preparar cuentas magnéticas, aliquot 12.5 microlitros de perlas CD3/CD28 de Activador T Humano por muestra ATAC-seq a un tubo de 1,5 mililitros. Agregue un mililitro de 1x PBS al tubo, y colóquelo en un imán durante un minuto para lavar las cuentas. Retire y deseche cuidadosamente el sobrenadante transparente y retire el tubo del imán.

Resuspender las perlas en 13 microlitros de RPMI completa por muestra ATAC-seq. Para activar las células CD4+T con la concentración ajustada, recoja 500.000 células en 2,1 mililitros de medio RPMI completo en un tubo cónico de 15 mililitros. Añadir 12,5 microlitros de perlas de T-Activator humana, preparadas y lavadas en pasos anteriores, y mezclar suavemente invirtiendo el tubo.

Luego transfiera suavemente las células, con cuentas, a un depósito estéril. Usando una pipeta multicanal, platee 200 microlitros de células con cuentas por pozo de una placa redonda de 96 pozos, e incubar en una incubadora de 37 grados Celsius, 5%CO2 durante 48 horas. Después de la incubación completa, centrifugar la placa a 423 veces G, y la temperatura ambiente, durante ocho minutos.

Retire 100 microlitros de medio de cada pozo, y recójalos en un tubo cónico antes de desecharlos, con el fin de confirmar que no hay pérdida de cordón. Luego resuspender el pellet celular en los 100 microlitros restantes de medio, y recoger todo en un tubo de 1,5 mililitros. Para aislar las células CD4+, agregue 50 microlitros de perlas conjugadas CD4 prelavadas a 500.000 células en un mililitro de RPMI completa e invierta para mezclar.

Incubar durante 20 minutos a cuatro grados centígrados, mientras que la mano se mueve cada seis minutos para mezclar. Coloque el tubo sobre el imán durante dos minutos, hasta que el sobrenadante esté limpio y, a continuación, retire y deseche. Retire el tubo del imán.

Lave las células unidas a cuentas resusppendándolas en un mililitro de PBS, más 2%FCS, y coloque el tubo de nuevo en el imán durante un minuto. Deseche el sobrenadante transparente y repita este proceso para un total de tres lavados. Después del lavado final, coloque el tubo en el imán durante un minuto.

Retírelo, deseche el sobrenadante y coloque el pellet sobre hielo. A continuación, para realizar el aislamiento de núcleos, resuspender las perlas y células en 50 microlitros de tampón de lelisis fría, y centrifugar inmediatamente a 500 G, cuatro grados Celsius, durante 10 minutos. Retire y deseche el sobrenadante.

Para realizar la reacción de la transposasa, resuspender el pellet de núcleos aislados con 50 microlitros de mezcla de transposasa Tn5. Incubar en un termociclador durante 30 minutos a 37 grados celsius, con la tapa ajustada a 40 grados celsius, y luego mantener a cuatro grados Celsius cuando esté completo. Inmediatamente después del termociclo, realice un giro rápido de centrífuga en la parte superior del banco.

Coloque el tubo en el imán durante un minuto para retirar las perlas del producto. Sin extraer el tubo del imán, transfiera el sobrenadante transparente a una columna de purificación de ADN. Lave la columna una vez con 250 microlitros de tampón PB, y dos veces con 750 microlitros de tampón de PE.

A continuación, agregue 10 microlitros de búfer de elución para eluir la muestra. Configure la reacción inicial de amplificación de PCR en un tubo PCR libre de nucleasas. Coloque el tubo PCR en el termociclador y ejecute el programa de amplificación de PCR.

A continuación, complete la amplificación final de PCR de los 45 microlitros restantes de reacción PCR, como se describe en el manuscrito. Coloque el tubo PCR en el termociclador y ejecute el programa. Después de la amplificación completa, purifique las bibliotecas utilizando un kit de limpieza de PCR, siguiendo el protocolo del fabricante, elutando en 25 microlitros del búfer de elución.

Secuenciar las bibliotecas preparadas en un secuenciador de próxima generación a una profundidad de lectura media de 42 millones de lecturas por muestra. Este protocolo ATAC-seq mejorado produjo una biblioteca final de más de un nanogramos por microlitro para la secuenciación. El control de calidad mostró fragmentos de ADN entre 200 y 1.000 pares de bases, y se realizó una mayor secuenciación con estas bibliotecas de alta calidad.

Las bibliotecas preparadas siguiendo este protocolo mostraron sólo 3% contaminación mitocondrial. El alto porcentaje de lecturas utilizables es lo suficientemente constante en todas las réplicas biológicas. Este protocolo proporcionaba resultados altamente reproducibles a través de réplicas técnicas, así como réplicas biológicas.

Además, este protocolo tardó 48 horas, en lugar de una semana o más como se describió anteriormente, lo que resulta en una activación coherente y eficiente, como lo demuestran los resultados de secuenciación reproducibles. Además, la canalización de análisis llamó con precisión a los picos ATAC-seq previstos. El análisis de resultados de secuenciación reveló cambios claros en el estado de la cromatina durante la activación de células T humanas.

Se identificaron regiones diferencialmente accesibles de cromatina abierta entre seis muestras antes y 48 horas después de la activación. Asegúrese de que la reacción de la lysis de los núcleos se realiza con reactivos y materiales refrigerados, con el fin de maximizar la recuperación de núcleos intactos. Nuestro tampón de lyis de núcleos modificados es más suave en las células, y minimiza el ADN mitocondrial contaminante.

Esperamos que este búfer de lelisis modificado se aplique también a ATAC-seq de un solo núcleo. Sabemos que este protocolo permitirá a los investigadores producir datos ATAC-seq de mayor calidad a un costo reducido, ayudando a reenviar el campo epigenético. El protocolo es sencillo, rápido y no requiere ningún reactivo o instrumento peligroso, por lo que es fácilmente accesible para los nuevos en ATAC-seq.