Name: 从小鼠垂体中开发类器官作为 体外 模型以探索垂体干细胞生物学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 了解从小鼠垂体中分离干细胞并构建三维类器官培养模型的完整实验流程。该技术为研究垂体干细胞生物学、腺体发育及肿瘤生长提供了可靠的体外研究平台。

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本工作获得了鲁汶大学研究基金和弗兰德斯科学研究基金（FWO）的资助。E.L.（11A3320N）和 C.N.（1S14218N）获得了FWO/FWO-SB博士奖学金的支持。

本研究的动物实验已获得鲁汶大学动物实验伦理委员会批准（P153/2018）。所有小鼠均饲养于该校动物实验中心的标准条件下（温度恒定为23 ± 1.5 °C，相对湿度40%–60%，昼夜节律12小时交替），并可自由获取水和食物 随意摄取.
1. 小鼠
<ol>
	<li>使用市售的小鼠品系，例如8至12周龄的年轻成年C57BL/6J小鼠。通常情况下，2至3只小鼠即可为本方案提供足够数量的腹膜腔淋巴细胞（AL细胞）。</li>
</ol>
2. 小鼠附睾脂肪组织的分离与解离
注意：培养基 A、B 和 C 需预先配制19,20。成分见表 2。
<ol>
	<li>小鼠AL的分离
	<ol>
		<li>采用CO2窒息法处死小鼠，随后进行断头（图2A）。用去离子水清洗小鼠头部以去除血液，并喷洒70%乙醇以建立无菌环境。</li>
		<li>使用无菌外科器械，去除两耳之间头部的皮肤（图2B）。</li>
		<li>打开颅骨并取出脑组织。
		<ol>
			<li>用无菌剪刀剪断“鼻梁”（即额骨的前部；图2B）。</li>
			<li>从已剪断的鼻梁处开始，沿两侧向耳朵方向继续用剪刀扩大颅骨开口（图2C）。</li>
			<li>使用无菌镊子取出颅骨和脑组织，注意避免触碰垂体（图2D）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>用钝头镊子小心去除鞍膈（diaphragma sellae），避免损伤垂体。在体视显微镜下弃除AL中的PL和IL。 
		注：PL和IL相互连接，因此可同时去除。这些部分呈白色组织，与粉红色的AL形成对比（图2D）。</li>
		<li>用钝头镊子仔细分离AL，并将其收集至一个装有3 mL培养基A的10 mL锥形瓶中（见表2）。将锥形瓶置于冰上，待后续处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠AL的消化解离
	<ol>
		<li>移除含有已分离AL的锥形瓶中的上清液（SN）培养基A。加入2 mL预热至37 °C的2.5%胰蛋白酶溶液，在37 °C下孵育15分钟。</li>
		<li>不移除胰蛋白酶溶液，直接加入2 mL预热至37 °C的DNase溶液（2 µg/mL，溶于培养基A中；经0.22 µm滤膜无菌过滤），轻轻摇动锥形瓶10次。静置约1分钟使垂体沉降至底部，然后移除上清液。</li>
		<li>加入2 mL预热至37 °C的胰蛋白酶抑制剂溶液（0.1 mg/mL，溶于培养基A中；经0.22 µm滤膜无菌过滤），在37 °C下孵育10分钟。待垂体沉降后，移除上清液。</li>
		<li>加入2 mL预热至37 °C的培养基B（见表2），在37 °C下孵育5分钟。不移除上清液，再加入2 mL预热至37 °C的培养基C（见表2），在37 °C下继续孵育15分钟。</li>
		<li>静置使垂体沉降至底部，移除上清液。用预热至37 °C的培养基C清洗垂体三次。</li>
		<li>将垂体组织解离为单细胞。
		<ol>
			<li>加入2 mL预热至37 °C的培养基C。使用无菌火焰抛光的巴斯德移液管反复吹打垂体组织多次，直至肉眼不可见组织碎片。</li>
			<li>将细胞悬液转移至含4.5 mL预热至37 °C的DNase溶液（2 µg/mL，溶于培养基A中；经0.22 µm滤膜无菌过滤）的15 mL离心管中。用2 mL预热至37 °C的培养基C清洗锥形瓶三次，并将清洗液一并转移至15 mL离心管中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>混匀收集的细胞悬液，经40 µm细胞筛过滤至30 mL离心管中。用2 mL培养基C清洗15 mL离心管和细胞筛三次，并将清洗液转移至30 mL离心管中。</li>
		<li>将装有2 mL 3%牛血清白蛋白（BSA）溶液（溶于培养基A中；经0.22 µm滤膜无菌过滤）的玻璃巴斯德移液管管尖置于离心管底部，缓慢吹出液体以形成可见的密度梯度层。在4 °C下以190 × g离心10分钟。</li>
		<li>通过一次性倒置离心管的方式移除上清液，并用P1000吸头吸除残留的上清液滴。将细胞沉淀重悬于1 mL冰上预冷的高级DMEM/F12（Adv DMEM/F12）培养基中，使用细胞计数仪对细胞进行定量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. AL来源类器官的建立与培养
注意：提前将 ECM 置于冰上解冻（1 mL 需 2-3 小时），并在整个实验过程中保持其处于冰上。
<ol>
	<li>类器官接种与培养
	<ol>
		<li>将AL细胞悬液在4 °C条件下以190 × g离心10分钟，弃上清液（SN）。用适量的Adv DMEM/F12&#160;重悬细胞沉淀，使细胞密度达到1.1 × 106 个细胞/mL。 
		&#8203;注意：例如，若细胞悬液浓度为500,000 个细胞/mL，则需将细胞沉淀重悬于454.54 µL的Adv DMEM/F12&#160;中，以达到目标密度1.1 × 106 个细胞/mL。</li>
		<li>根据类器官培养所需孔数，取相应体积的细胞悬液，并按30:70比例加入细胞外基质（ECM）（30%细胞悬液（溶于Adv DMEM/F12&#160;）和70% ECM）。通过移液器反复吹打充分混匀。 
		注意：例如，对于一个30 µL的液滴（见步骤3.1.3），应将9 µL细胞悬液（取自1.1 × 106 个细胞/mL的悬液，约含10,000个细胞）与21 µL ECM轻柔混合。</li>
		<li>每孔在预热（37 °C）的48孔板上接种30 µL细胞悬液与ECM的混合液（见步骤3.1.2）。将培养板倒置，于37 °C孵育20分钟，使ECM凝固。 
		注意：培养板需在37 °C预热至少24小时。</li>
		<li>将培养板恢复正向放置，每孔小心加入250 µL预热（37 °C）的PitOM培养基（见表1），并补充10 µM的ROCK抑制剂（Y-27632）。</li>
		<li>继续培养类器官，每2–3天更换一次培养基（不含Y-27632），直至类器官完全发育，通常需要10–14天（图3A）。随后进行传代。 
		注意：吸除培养基时，注意不要破坏ECM形成的半球状结构。可将培养板略微倾斜，从孔底边缘吸除培养基。新鲜培养基（预热至37 °C）应沿孔壁轻柔加入。若凝胶液滴脱落，应收集类器官，重新悬浮并接种于新的ECM液滴中继续培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官传代
	<ol>
		<li>轻柔吸除培养基，每孔加入400 µL冰浴的Adv DMEM/F12&#160;以溶解ECM，并将类器官转移至微量离心管中。用400 µL冰浴的Adv DMEM/F12&#160;洗涤一次。在4 °C条件下以200 × g离心5分钟。</li>
		<li>小心弃上清液，加入400 µL预热（37 °C）的TrypLE Express酶（1X）。通过反复倒置混匀，于37 °C孵育5分钟。</li>
		<li>加入400 µL冰浴的Adv DMEM/F12&#160;，在4 °C条件下以200 × g离心5分钟。弃上清液。</li>
		<li>用100 µL冰浴的Adv DMEM/F12&#160;重悬细胞沉淀，随后使用缩口的P200枪头剧烈吹打，直至获得直径约50 µm的类器官碎片（图3B）（操作方法：将空枪头轻压至微量离心管底部，以缩小其开口直径）。 
		注意：解离后的混合物应主要为类器官碎片，单细胞数量应极少。过度解离为单细胞会显著影响类器官的再生长能力。</li>
		<li>加入800 µL Adv DMEM/F12&#160;，在4 °C条件下以190 × g离心10分钟。弃上清液。</li>
		<li>以1:2至1:4的比例进行传代。根据接种需要，用适量Adv DMEM/F12&#160;重悬细胞沉淀，并按30:70比例加入ECM（30%细胞悬液和70% ECM）。通过移液器反复吹打充分混匀。</li>
		<li>按照上述步骤3.1.3–3.1.5的方法接种并培养类器官。 
		&#8203;注意：平均每孔由10,000个全AL细胞可形成约20个类器官（0.2%）。第0代（passage 0）类器官以1:2比例传代后，每孔可产生超过&#62;50个类器官（第1代，passage 1）。后续传代可继续以1:2至1:4的比例进行。约传代10次后（相当于培养3个月），类器官的再生长速度逐渐减慢，表现为类器官数量减少且体积变小。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. AL来源类器官的冷冻保存与解冻
<ol>
	<li>类器官的冷冻保存
	<ol>
		<li>按照传代方案从步骤 3.2.1 执行至步骤 3.2.5。</li>
		<li>用 1 mL 冷冻保存液（表 3）重悬类器官沉淀（包含类器官片段和细胞）。将悬液转移至冻存管中，并置于冰上。 
		&#8203;注意：最多可将 48 孔板中四个孔的类器官（即获得的片段和细胞）合并至同一支冻存管中。</li>
		<li>将冻存管放入程序降温盒中，并转移至 -80 °C 保存。</li>
		<li>24 小时后，将样品转移至冻存盒中，并置于液氮（-196 °C）中进行长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冻存类器官的复苏
	<ol>
		<li>从液氮罐中取出冻存管并立即置于冰上，随后立即开始复苏操作。</li>
		<li>在 37 °C 水浴中融化含有冻存类器官片段和单细胞的溶液。 
		注意：溶液在 37 °C 下停留时间不得超过 2 分钟，以避免 DMSO 对细胞产生毒性。</li>
		<li>将内容物转移至含有 10 mL 冰冷的含 30% 胎牛血清（FBS）的 Adv DMEM/F12 培养基的 15 mL 离心管中。用 1 mL 含 30% FBS 的 Adv DMEM/F12 培养基冲洗冻存管。&#160;&#160;</li>
		<li>在 4 °C 下以 190 × g 离心 10 分钟。用 1 mL 冰冷的 Adv DMEM/F12 培养基重悬沉淀，并将悬液转移至微量离心管中。&#160;</li>
		<li>在 4 °C 下以 190 × g 离心 10 分钟。根据接种需要，用适量的 Adv DMEM/F12 培养基重悬沉淀，并按 30:70 的比例加入细胞外基质（ECM）。通过移液上下吹打充分混匀。&#160;</li>
		<li>按照上述步骤 3.1.3–3.1.5 所述方法接种并培养类器官。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. AL 来源类器官的验证
<ol>
	<li>用于RNA提取的类器官收集与裂解
	<ol>
		<li>按照上述方法收集并离心类器官（步骤3.2.1）。</li>
		<li>弃去上清液，加入含1% 2-巯基乙醇的350 µL裂解缓冲液。涡旋振荡30秒，置于-80 °C保存或立即进行RNA提取。 
		&#8203;注意：2-巯基乙醇为有毒化合物，所有操作必须在化学通风橱中进行，并佩戴腈手套、防尘口罩和护目镜。2-巯基乙醇可对眼睛和皮肤造成不可逆损伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于免疫组织化学/免疫荧光染色的类器官固定与包埋
	<ol>
		<li>按照上述方法收集并离心类器官（步骤3.2.1）。</li>
		<li>弃去上清液，加入1 mL 4%多聚甲醛（PFA），在室温（RT）条件下于旋转摇床（100 rpm）上孵育30分钟。 
		注意：PFA为已知的人类致癌物，可导致角膜不可逆损伤。所有操作必须在化学通风橱中进行，且必须始终佩戴腈手套和护目镜。</li>
		<li>在200 x g 条件下离心5分钟，弃去上清液；加入1 mL PBS，在室温（RT）条件下于旋转摇床（100 rpm）上孵育10分钟，随后在4 °C条件下以90 x g 离心3分钟&#160;。重复洗涤步骤两次。将样品置于PBS中，4 °C保存。</li>
		<li>进行组织处理与脱水时，弃去上清液，使用预热的扩口p200吸头（通过切去吸头末端一小段制成），向类器官沉淀中加入150 µL 2%琼脂糖凝胶（溶于PBS）。立即吸取全部体积并排入微量离心管盖中。 
		说明：操作需迅速，因含有类器官的凝胶会迅速凝固。</li>
		<li>让凝胶充分固化30分钟，将凝胶片转移至组织学包埋盒中。浸入50%乙醇（EtOH）中保存，直至在组织处理仪中进行脱水。</li>
		<li>进行石蜡包埋时，用镊子将凝胶片放入包埋模具中，并注入温热石蜡（60 °C）。将模具置于4 °C直至石蜡完全凝固（约45分钟）。样品可在4 °C保存，或直接进行切片。</li>
		<li>使用切片机将含类器官的石蜡块切成5 µm厚度，将切片收集于载玻片上。在每张切片下方滴加一滴去离子水，以使切片充分伸展，并将载玻片置于37 °C平板加热器上过夜。切片载玻片可于4 °C保存，或直接进行免疫组织化学或免疫荧光染色。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者声明不存在竞争性财务利益。

此处所述的AL来源类器官是研究垂体干细胞的有力研究模型 体外 目前，这种类器官方法是可靠且稳健地培养和扩增垂体原代干细胞的唯一可用工具。已有研究报道，由胚胎干细胞（ESC）或诱导性多能干细胞（iPSC）衍生的垂体类器官模型，能够高度模拟垂体胚胎发育过程。23；然而，尽管其在研究垂体发育或构建垂体疾病模型方面具有重要价值23,24,25与本文所述方法相比，从ESC/iPSC开始的已报道方案耗时较长，且所产生的类器官无法扩增。
垂体干细胞类器官的成功培养依赖于实验方案中的若干关键步骤。在初始细胞接种时，接种适量的细胞数量至关重要。细胞数量过多会导致培养物过度拥挤，从而降低类器官的存活率并阻碍其充分扩张；而细胞数量过少则会导致类器官形成受限。此外，在培养过程中必须避免破坏细胞外基质（ECM）凝胶滴的完整性。添加或更换培养基时应极为小心，避...

垂体是一个微小的内分泌腺体，位于大脑底部，并与下丘脑相连。该腺体整合外周和中枢（下丘脑）输入信号，从而产生精确调节且协调的激素释放，进而调控下游靶向内分泌器官（如肾上腺和性腺），使其在适当的时间生成相应的激素。垂体是内分泌系统的关键调节器，因此恰当地被称为“主腺体”1。
小鼠垂体由三个叶组成（图1），即前叶（AL）、中间叶（IL）和后叶（PL）。主要的内分泌性前叶包含五种激素分泌细胞类型，包括分泌生长激素（GH）的生长激素细胞；分泌催乳素（PRL）的催乳激素细胞；分泌促肾上腺皮质激素（ACTH）的促肾上腺皮质激素细胞；负责促甲状腺激素（TSH）生成的促甲状腺激素细胞；以及产生黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）的促性腺激素细胞。后叶由下丘脑的轴突投射构成，其中储存有催产素和血管加压素（抗利尿激素）。中间叶位于前叶与后叶之间，含有分泌黑素细胞刺激素（MSH）的黑素细胞。在人类垂体中，中间叶在发育过程中退化，黑素细胞则散布于前叶内1。除了内分泌细胞外，垂体还含有一群干细胞，这些细胞主要由转录因子SOX2标记2,3,4,5,6。这些SOX2+细胞位于边缘区（MZ），即前叶与中间叶之间腔隙的上皮衬里处，或以细胞簇的形式分布于前叶实质中，从而提示垂体内存在两个干细胞微环境（图1）2,3,4,5,6。
鉴于垂体的不可或缺性，其功能异常可导致严重的病态。垂体功能亢进（表现为一种或多种激素过度分泌）和垂体功能减退（一种或多种激素产生缺陷或缺失）可由垂体神经内分泌肿瘤（PitNETs；例如促肾上腺皮质激素分泌性肿瘤导致库欣病）或遗传缺陷（例如生长激素缺乏导致侏儒症）引起。7此外，垂体手术（如切除肿瘤）、感染（如下丘脑-垂体结核，或细菌性脑膜炎或脑炎后的感染）、席汉综合征（因分娩时大出血导致血流不足引起的坏死）、垂体卒中以及创伤性脑损伤也是导致垂体功能减退的重要原因。8已证明小鼠垂体具有再生能力，能够修复由内分泌细胞转基因消融所引起的局部损伤9,10SOX2+ 干细胞在遭受损伤后会迅速作出反应，表现出活化表型，其特征是增殖增强（导致干细胞扩增）以及干细胞相关因子和通路（如 WNT/NOTCH）表达上调。此外，干细胞开始表达被消融的激素，最终在随后的（5至6）个月内实现耗竭细胞群体的显著恢复。9,10此外，在腺体的新生儿成熟阶段（出生后的前3周），垂体干细胞处于活跃状态并大量增殖6,11,12,13，而生物体衰老则与功能衰退相关 原位 干细胞功能受损，源于衰老过程中炎症性（微）环境的加剧（即“炎症性衰老”）10,14此外，腺体中的肿瘤发生也与干细胞的活化相关。7,15尽管已在多种垂体重塑情况下检测到干细胞的激活（详见综述于7,16），其潜在机制仍不明确。由于 体内 方法（例如在转基因小鼠中进行谱系示踪）未能提供关于垂体干细胞及其发育的清晰或全面的认识，可靠的 体外 建立模型以探索正常和病变垂体中干细胞生物学至关重要。标准 体外 由于原代垂体干细胞增殖能力极为有限，且在非生理性的二维培养条件下表型迅速丧失，其培养至今仍不充分（更详细的综述见163D球形培养物（垂体球）已从侧群细胞和SOX2鉴定出的垂体干细胞建立+ 表型2,3,4垂体球体由干细胞克隆性生长而来，表达干性标志物，并具有向内分泌细胞类型分化的潜能。然而，其扩增能力有限，传代次数较少（仅能传代2-3次）。3,4球状结构也可从非解离的垂体干细胞簇在50%稀释的Matrigel中培养1周后获得，但未表现出扩增能力17垂体球体方法主要用作干细胞数量的检测工具，但由于其扩增能力较差，进一步的应用受到限制16.
为解决并克服这些不足，近期建立了一种新的三维模型，即来源于小鼠主要内分泌腺垂体（AL），包含边缘区（MZ）和实质干细胞的类器官。研究表明，这些类器官确实起源于垂体干细胞，并能真实再现其表型。18此外，这些类器官具有长期扩增能力，同时能稳定维持其干性特征。因此，它们为扩增原代垂体干细胞以进行深入探索提供了可靠方法。而通过垂体组织分离获得的干细胞数量有限，且无法在二维条件下扩增，难以实现此类研究。16已证明类器官是揭示垂体干细胞新特性的宝贵且可靠的工具（可转化为 体内)14,18重要的是，类器官模型忠实地再现了垂体干细胞在局部组织损伤和新生儿成熟过程中发生的激活状态，表现出增强的形成效率，并重现了上调的分子通路14,18因此，垂体来源类器官模型是一种创新且强大的垂体干细胞生物学研究模型，同时也是一种干细胞激活的检测工具。
本方案详细描述了小鼠垂体来源类器官的建立过程。为此，首先分离腺垂体（AL）并将其解离为单细胞，随后将细胞包埋于模拟细胞外基质的Matrigel（下文简称ECM）中。将细胞-ECM复合物置于特定培养基中培养，该培养基主要包含干细胞生长因子和垂体胚胎发育调控因子（下文简称“垂体类器官培养基”（PitOM）18；表1）。类器官在培养10–14天完全发育后，可通过连续传代进一步扩增，并用于多种下游分析（如免疫荧光、RT-qPCR以及批量或单细胞转录组学；图1）。从长远来看，垂体干细胞类器官有望为组织修复和再生医学开辟新途径。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>48孔板，TC处理，独立包装</td><td>Costar</td><td>734-1607</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>高级DMEM/F12培养基</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（细胞培养级）</td><td>Serva</td><td>47330</td><td></td></tr><tr><td>B-27添加剂（50倍浓缩），不含维生素A</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>包埋模具</td><td>VWR</td><td>720-1918</td><td></td></tr><tr><td>RLT缓冲液</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td></td></tr><tr><td>Q Path Microtwin包埋盒</td><td>VWR</td><td>720-2191</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤筛，40 &amp;micro;m孔径，一次性使用</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>霍乱毒素（来源于&lt;em&gt;Vibrio &lt;/em&gt;cholerae）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Merck</td><td>108342</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM培养基粉末，高糖型</td><td>Gibco</td><td>52100039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock离心管，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Epredia SuperFrost Plus防脱载玻片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Epredia HistoStar组织包埋工作站，220至240Vac</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587976</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇，99.8%以上</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10342652</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX添加剂</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HEPES缓冲液</td><td>Gibco</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>InSolution Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>688001</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel生长因子减少型（GFR）基底膜基质，无LDEV</td><td>Corning</td><td>15505739</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty冷冻容器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>N-2添加剂（100倍浓缩）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>N-乙酰-L-半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>Nunc生物样本库与细胞培养用冻存管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375353</td><td></td></tr><tr><td>用于合成的多聚甲醛（PFA）</td><td>Merck</td><td>818715</td><td></td></tr><tr><td>PBS，pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>青霉素G钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液（10,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>Merck</td><td>107241</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>重组人EGF蛋白，CF级</td><td>R&amp;D systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>重组人碱性成纤维细胞生长因子/FGF2/bFGF（157个氨基酸）蛋白</td><td>R&amp;D systems</td><td>234-FSE</td><td></td></tr><tr><td>重组人FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>重组人IGF-1</td><td>Peprotech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>重组人IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>重组人Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>重组人R-Spondin-1</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>重组人/鼠FGF-8b</td><td>Peprotech</td><td>100-25</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠Sonic Hedgehog/Shh（C25II）N端片段</td><td>R&amp;D systems</td><td>464-SH</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy微量试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>BDH</td><td>102415K</td><td></td></tr><tr><td>一水合磷酸二氢钠</td><td>PanReac-AppliChem</td><td>A1047</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO3）</td><td>Merck</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（C3H3NaO3）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Stericup-GP滤器，0.22 &amp;micro;m</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP无菌离心管顶部滤器，0.22 &amp;mu;m</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>无菌水</td><td>Fresenius</td><td>B230531</td><td></td></tr><tr><td>硫酸链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Excelsior ES组织处理仪</td><td>Thermo Scientific</td><td>12505356</td><td></td></tr><tr><td>Titriplex III</td><td>Merck</td><td>108418</td><td></td></tr><tr><td>TrypL Express酶（1倍浓度），含酚红</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605028</td><td></td></tr><tr><td>大豆（Glycine max）胰蛋白酶抑制剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9003</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶溶液 2.5%</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr></tbody></table>

从小鼠垂体开发类器官 体外 探索垂体干细胞生物学的模型

Development of Organoids from Mouse Pituitary as In Vitro Model to Explore Pituitary Stem Cell Biology

垂体是调节多种关键生理过程的主控内分泌腺体，包括身体生长、代谢、性成熟、繁殖以及应激反应。十多年前，垂体中被发现存在干细胞。然而，尽管已应用转基因技术 体内 方法、表型、生物学特性及其作用仍不明确。为解决这一难题，一种新颖且创新的类器官 体外 模型被用于深入揭示垂体干细胞生物学。类器官是指在特定培养条件下，由组织（上皮）干细胞自我发育形成的三维细胞结构，能够重现这些干细胞及其来源组织的多种特征。本文表明，小鼠垂体来源的类器官由腺体中的干细胞发育而来，并忠实地重现了其干细胞特性 体内 表型和功能特征。其中，它们能够重现干细胞的活化状态 体内 在响应转基因诱导的局部损伤时发生。这些类器官具有长期扩增能力，同时能强有力地维持其干性表型。这一新的研究模型对于解析干细胞在垂体重塑关键条件下的表型与行为具有重要价值，涵盖从新生期成熟到衰老相关功能衰退，以及从健康到病变腺体的多种状态。本文提供了一套详细的实验方案，用于建立小鼠垂体来源的类器官，为深入探索垂体干细胞这一尚不明确的领域提供了有力工具。

在分离和解离肾上腺外侧区（AL）后，将获得的单细胞接种于细胞外基质（ECM）中，并在PitOM培养基中培养（图1，表1）。图3A展示了接种时（第0天）的细胞培养状态及细胞密度。此时可能可见少量细小碎片（图3A，白色箭头），但在传代过程中会消失。接种14天后，来源于AL的类器官已完全发育（图3A）。这些类器官呈现囊状形态，由一层上皮细胞包裹形成管腔结构。在此阶段，类器官直径可达500 µm，需进行传代。图3B显示了传代后AL来源类器官培养物在重新接种解离的类器官片段后指定时间点的生长情况。
有时，类器官培养物中可能会出现一个或多个致密结构（图3A，不良情况）。在传代过程中，致密类器官容易占据主导地...

垂体是机体内分泌系统的关键调节器官。本文介绍了一种从小鼠垂体发育而来类器官的新颖三维体外模型，用于研究垂体干细胞群体，而该群体的生物学特性与功能目前仍知之甚少。

垂体是调节关键生理过程的主要内分泌腺，包括身体生长、代谢、性成熟、繁殖等。

我们的类器官模型在探索垂体干细胞生物学方面具有重要价值，不仅适用于稳态条件，也适用于垂体重塑条件，例如腺体的新生儿成熟期、与衰老相关的功能衰退以及腺体内的肿瘤生长。迄今为止，我们的垂体类器官技术是唯一能够可靠且稳健地培养和扩增原代小鼠垂体干细胞的工具。本实验操作将由我研究团队的博士研究生 Emma Laporte 和 Charlotte Nys 演示。首先，用去离子水清洗小鼠头部以去除血液。在头部喷洒70%乙醇以创造无菌环境。然后，使用无菌外科工具去除两耳之间的皮肤。打开颅骨时，使用无菌剪刀折断鼻梁。从鼻梁开始，向两侧耳部方向进一步撑开颅骨。使用无菌镊子取出颅骨和脑组织，注意不要触碰垂体。用钝头镊子去除鞍膈。然后在体视显微镜下将腺垂体前叶与后叶及中间叶分离。用钝头镊子小心分离前叶，并将其收集至含有3毫升A培养基的10毫升锥形瓶中。加入2毫升预热的2.5%胰蛋白酶溶液。在37摄氏度下孵育15分钟。加入2毫升预热的DNA酶溶液，轻轻旋转锥形瓶10次。静置使垂体沉降至底部，然后移除上清液。加入2 mL预热的胰蛋白酶抑制剂溶液，在37°C下孵育10分钟。当垂体沉至底部时，移除上清液。加入2 mL预热的B培养基，孵育5分钟。向其中加入 2 毫升预热的 C 培养基，孵育 15 分钟。让垂体沉至管底，吸去上清液。然后用预热的 C 培养基清洗三次。加入 2 毫升预热的 C 培养基。用无菌、火焰抛光的巴斯德吸管反复吹打垂体组织多次，直至肉眼不可见组织碎片为止。将悬液转移至含有4.5毫升预热DNA酶溶液的15毫升离心管中。用2毫升预热的C培养基冲洗培养瓶三次，并将悬液转移至该离心管中。混匀收集的细胞悬液，然后通过40微米细胞滤网过滤至30毫升离心管中。用2毫升培养基C将离心管和细胞滤筛冲洗三次，并将悬液转移至离心管中。用2毫升BSA填充玻璃巴斯德吸管。将吸管尖端置于离心管底部，轻轻吹出，形成可见的密度层。在4°C条件下，以190 × g离心10分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1毫升冰预冷的高级DMEM/F-12培养基中。随后使用细胞计数仪对细胞进行定量。在4°C条件下，以190 × g离心细胞悬液10分钟，弃上清液。用高级DMEM/F-12培养基重悬细胞沉淀，调整细胞密度至每毫升1.1 × 10⁶个细胞。按30:70的比例将ECM加入所需体积的细胞悬液中，并充分混匀。在预热的48孔板的每个孔中加入30微升该混合液。将培养板倒置，于37摄氏度下孵育20分钟，使ECM凝固。孵育结束后，小心加入250微升预热的垂体类器官培养基，培养基中添加10微摩尔的ROCK抑制剂。每两到三天更换一次不含ROCK抑制剂的培养基，持续10至14天，直至类器官完全生长。传代类器官时，首先轻轻吸除培养基，加入400微升预冷的高级DMEM/F-12培养基以解离细胞外基质（ECM）。随后，将类器官收集至微量离心管中。用400微升预冷的高级DMEM/F-12洗涤孔板。在4摄氏度下，以200 ×g离心5分钟。弃去上清液，加入400微升预热的TrypLE Express酶。通过反复倒置管子混匀，于37摄氏度孵育5分钟。加入400微升预冷的高级DMEM/F-12培养基。在4摄氏度下以200 × g离心5分钟，弃去上清液。用100 µL预冷的高级DMEM/F-12重悬沉淀。收窄P-200枪头，用该枪头通过剧烈吹打解离类器官，直至获得类器官碎片。加入800 µL高级DMEM/F-12。在4°C条件下以190 × g离心10分钟，弃去上清液。传代类器官时，将沉淀物重悬于适量体积的改良型DMEM/F-12培养基中，并以30:70的比例加入细胞外基质（ECM），充分混匀。按照文稿中所述方法继续进行类器官的接种与培养。将垂体前叶解离得到的单个细胞接种于细胞外基质（ECM）中，并在垂体类器官培养基中进行培养。接种后14天，类器官已完全发育，直径可达500微米。在此阶段，类器官呈现出囊状形态，由上皮层包裹着管腔。不建议使用生长后出现致密结构的孔。传代时，使用类器官碎片进行接种。传代7天后，观察到具有囊状结构的类器官生长良好。应弃去致密的类器官，因为生长不良的类器官可能在培养中占据主导。对上皮标志物E-cadherin以及细胞角蛋白8和18进行免疫荧光染色分析，证实了类器官的上皮特性。垂体干细胞标志物 Sox2 和 Trop2 的表达表明类器官具有干细胞特性，而垂体特异性标志物 LHX3 则显示了类器官的垂体表型。增殖标志物 Ki67 的表达表明构成类器官的细胞处于增殖状态。实时定量 PCR 分析显示，即使经过多次传代，类器官中干细胞标志物的表达水平仍高于前叶组织，证实了干细胞的富集。在初始接种时，将适当数量的单细胞接种于ECM凝胶滴中至关重要；而在传代类器官时，必须注意重新接种组织碎片而非单细胞。

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发育生物学

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体外 从小鼠胚胎前体细胞诱导胰腺器官发生

本文介绍了一种从悬浮培养的 e10.5...

由小鼠胰腺前体细胞生成无支架三维胰岛素表达胰腺类器官 体外

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从小鼠肝外胆管生成类器官

我们展示了一种用于小鼠前列腺癌模型的尸检及解剖方法，重点介绍前列腺肿瘤的分离。同时提供了一步一步建立小鼠前列腺肿瘤类器官的实验方案。...

利用前列腺癌基因工程小鼠模型生成肿瘤类器官

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我们提供了生成和表征基于人诱导性多能干细胞（hIPSC）的2D和3D新皮质发育模型的详细方案，以及用于定性和定量分析初级纤毛（PC）发生与功能的互补方法。...

基于人诱导性多能干细胞的二维和三维模型解析初级纤毛在新皮质发育中的作用

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建立人类牙齿类器官：推动机制研究与再生治疗的有力工具

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从小鼠垂体开发类器官体外探索垂体干细胞生物学的模型

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