Questa procedura descrive come stabilire colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino ed è seguita dalla trasfezione con il gene Pulser sistema di elettroporazione MXCell.
E 'sempre più evidente che elettroporazione è il modo più efficace per introdurre DNA plasmidico o siRNA in cellule primarie. Il gene Pulser sistema di elettroporazione MXcell e Gene buffer di elettroporazione Pulser sono stati specificamente sviluppati per trasfettare acidi nucleici nelle cellule dei mammiferi e di difficile trasfezione delle cellule, come i video cells.This primarie e staminali dimostra come stabilire colture primarie di cellule emopoietiche dal midollo osseo murino , e poi li preparano per l'elettroporazione nel sistema MXcell. Si comincia isolando femore e della tibia. Midollo osseo da femore e della tibia vengono poi raccolte e le culture sono stabiliti. Colture di cellule del midollo osseo sono poi transfettate e analizzati.
Come più informazioni genomiche emerge e nuovi strumenti come siRNA sono sviluppati, l'uso di cellule fisiologicamente rilevanti è diventato sempre più importante per migliorare la nostra comprensione delle vie di malattia, interazioni proteina-proteina, e la trasduzione del segnale. Pile sono ottenute direttamente da tessuti o fluidi e coltivate in vitro. Queste cellule possono essere manipolati in vari modi, anche attraverso l'introduzione di materiale genetico esogeno. E 'sempre più evidente che il modo più efficace per introdurre DNA plasmidico o siRNA in cellule primarie è elettroporazione.
Elettroporazione espone le cellule a impulsi elettrici al fine di aumentare temporaneamente la permeabilità della membrana cellulare, consentendo in tal modo esogeno acidi nucleici per entrare nella cellula. Questo metodo di trasfezione può essere ottimizzato per accogliere le differenze tra diversi tipi di cellule / linee e, quindi, può essere utilizzato per trasfettare mastociti così come qualsiasi altro osso cellule derivate dal midollo. Inoltre, a differenza virale mediata trasfezione, elettroporazione non impone limiti alle dimensioni del DNA transfettate, né richiedono una preparazione. A differenza dei lipidi mediata trasfezione, elettroporazione può essere meno tossico e non dia luogo a cattura endosomiali degli acidi nucleici transfettate.
Bio-Rad ha sviluppato il sistema di elettroporazione MXcell appositamente per queste cellule. il MXcell consente di variare le condizioni per massimizzare l'efficienza di trasfezione e la vitalità cellulare. Al fine di ottimizzare l'efficienza di trasfezione e ridurre al minimo la morte delle cellule, una moltitudine di parametri tra cui elettroporazione tensione, capacità, resistenza e durata dell'impulso può essere regolata e valutati.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Gene Pulser MXcell Electroporation System | Bio-Rad | 165-2670 | ||
Gene Pulser Electroporation Buffer | Bio-Rad | 165-2677 |