Assay för Neural induktion i Chick Embryo
Summary
Neural induktion är det första steget i bildandet av hjärnan. Det är en mekanism genom vilken Hensen nod (arrangör), instruerar kringliggande vävnad att anta ett neuralt öde, dvs att ge upphov till nervsystemet. Denna video visar en analys av neurala induktion i kycklingembryo.
Abstract
Den kycklingembryo är ett värdefullt verktyg i studiet av tidiga embryonala utvecklingen. Dess öppenhet, tillgänglighet och enkel manipulation, gör det ett idealiskt verktyg för att studera bildning och första anläggningen av nervsystemet. Denna video visar hur du ympa arrangör vävnad i en värd, en metod som Hensen s nod (arrangören i kycklingembryo) är ympade på en värd behörig ektoderm. Arrangören graft instruerar överliggande na har vävnad för att anta ett neuralt öde via neurala förmå signaler. Denna mekanism kallas neurala induktion, och utgör det första steget i bildandet av hjärnan och ryggmärgen i amnioternas. Denna metod är i huvudsak används för karakterisering av förmodade neurala förmå molekyler i chick. Denna video visar de olika stegen i analysen för neural induktion, det första är donnor embryot uttagna och fästs på ett fat. Sedan är värd embryot förberedd för ny kultur. Transplantatet är censurerade och transplanteras till värden området pellucida marginal. Värden är odlade på 18-22 timmar. Monteringen är fast och bearbetas för ytterligare tillämpningar (t.ex. in situ hybridisering). Denna metod var ursprungligen utformades av Waddington<sup> 1,2</sup> Och Gallera<sup> 3,4</sup>.
Protocol
Discussion
Denna video visar de olika stegen för att utföra ett test för neural induktion; Denna analys är i huvudsak används för karakterisering av förmodade neurala förmå molekyler i chick, och därmed kan användas för en mängd olika tillämpningar, från embryologiska micromanipulations 1-4; 6 att reda nytt signalsystem kaskader 7,8, som syftar till förståelse av det första steget i bildandet av hjärnan och övriga nervsystemet.
Acknowledgements
DP är mottagare av Ruth Kirschstein Award 1F32 DA021977-01A1 från National Institute on Drug Abuse. Detta arbete stöddes av Margaret M. Alkek Foundation för att RHF.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Eggs | Animal | Charles River Laboratories | Premium Fertile | Fertilized, HH3+ (14 hr) |
| Stereomicroscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ9.5 or similar | |
| Hybridization Incubator | Equipment | Robbins Scientific | M1000 | Use with inverted Pyrex dish and 500 ml ddH2O beaker |
| Marsh Automatic Incubator | Equipment | Lyon | RX | |
| Pyrex dish | ||||
| Watchmaker’s glass 50mm | Tool | VWR | 66112-060 | |
| Glass rings | Tool | Physical Plant facility | cut 4 mm thick sections of glass tubing (27 mm outer diam, 25 mm inner diam). Do not fine polish. | |
| Curved Forceps (1) | Tool | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Forceps (2) | Tool | Fine Science Tools | 11002-13 | blunt ended using sharpening Stone and 100ul mineral oil |
| Fine scissors | Tool | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Plastic dishes | Tool | Falcon | 353001 | |
| Rubber Bulb | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70980 | |
| DiI | Reagent | Invitrogen | D-282 | |
| Aspirator tube assembly | Tool | Sigma | A5177-5EA | |
| Microelectrode puller | Equipment | Sutter Instruments | Sutter Instruments P-97 Flaming/Brown Micropipette | |
| Pasteur Capillary Pipette | Tool | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | round edge under flame |
| Culture chamber | Tool | Pioneer Plastics | 030C | |
| Microcapillary tube | Tool | Sigma | P1049-1PAK | |
| Microdissecting knife | Tool | Fine Science Tools | 10056-12 | Use to puncture cavities prior to in situ hybridization |
| Minuten pins 0.2mm diam | Tool | Fine Science Tools | 26002-20 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Reagent | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base | Dow Corning | 0001986475 | Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C | |
| Diethylpyrocarbonate (depc) | Acros Organics | 10025025 | Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave | |
| 16% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
References
- Waddington, C. H. Experiments on the development of chick and duck embryos, cultivated in vitro. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 221, 179-230 (1932).
- Waddington, C. H. Induction by the primitive streak and its derivatives in the chick. J. Exp. Biol. 10, 38-46 (1933).
- Gallera, J. Excision et transplantation des différentes régions de la ligne primitive chez le poulet. C. R. Ass. Anat. 49, 632-639 (1964).
- Gallera, J. Primary induction in birds. Adv. Morph. 9. , 149-180 (1971).
- Serbedzija, G. N., Fraser, S. E., Bronner-Fraser, M. Pathways of neural crest cell migration in the mouse embryo as revealed by vital dye labeling. Development 108. , 605-612 (1990).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen’s node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development 122. , 3263-3273 (1996).
- Joubin, K., Stern, C. D. Molecular interactions continuously define the organizer during the cell movements of gastrulation. Cell. 98, 559-571 (1999).
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. , 406-474 (2000).
- Psychoyos, D., Finnell, R. Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture. JoVE. 20, 10-3791 (2008).
