إعداد وحيدة الخلية معلقات من الطحال ماوس مع Dissociator gentleMACS

Summary

هذا الفيديو يصف بسيطة ، لتوفير الوقت للتقنية تفارق نسيج الآلي باستخدام Dissociator gentleMACS لإعداد وحيدة الخلية تعليق splenocytes من الماوس.

Abstract

وحيدة الخلية المعلقات هي شرط مسبق لإجراء التجارب في فصل الخلايا ، خلية التحليل والثقافة الخلية. لتجنب dissociations دليل شاقة ومؤلمة في كثير من الأحيان Dissociator gentleMACS يسمح احد لفصل الأنسجة بكفاءة عالية في ظل ظروف رقابة واستنساخه. يمكن أن تنأى Dissociator gentleMACS الأمثل الماوس الطحال ، والجمع والتوحيد للوقت مع السلامة مستخدم. هذا الفيديو يصف كيفية فصل الطحال باستخدام الماوس Dissociator gentleMACS ، وهو المقعد الآلي قمة الجهاز الذي يمكن أن يحدث خللا ميكانيكيا الأنسجة باستخدام أنابيب خاصة لانتاج معلقات خلية قابلة للحياة. بعد تفكك ، يتم تصفية الطحال ، طرد ، ومعلق لمزيد من الطلبات.

Protocol

مقدمة لمعدات فصل الأنسجة بلطف ، وذلك باستخدام أنابيب البنفسج C إلى تعليق وحيد الخلية قادرة على البقاء. يستخدم EDTA العازلة PBS / جيش صرب البوسنة لفصل الخلايا. مستعدة العازلة إضافة 1 جزء من الحل للسهم BSA إلى 20 أجزاء من autoMACS الشطف محلول يحتوي على EDTA. وتستخدم في فصل تمهيدي MACS مرشحات بحيث ينفصل عينات الأنسجة خالية من جميع كتل الخلية ، وتعزيز نجاح MACS الانفصال وتحليل لاحقة. عدم الربط بين خلايا الطحال والطحال disscociated كله الى وحيد الخلية من معلقات splenocytes باستخدام Dissociator gentleMACS. للبدء في الإجراءات ، تحميل أنبوب C مع حجم المخزن المؤقت وفقا لكتلة الطحال. والطحال السليم للماوس الكبار BALB / ج الشابات يزن حوالي 80-120 ملغ. كل الطحال 1 إلى 2 من هذه الكتلة يتطلب 3 مل من العازلة. الطحال من الحيوانات القديمة أو الحيوانات مع الالتهابات غالبا ما تكون أكبر ويجب أن يوزن العازلة. ويجب توسيع وحدات التخزين العازلة وفقا لذلك. لا يتجاوز حجم المخزن ما مجموعه 10 مل. تشريح الطحال إضافة إلى أنبوب C تحتوي على 3 مل من العازلة. تأكد من أن غطاء الأنبوبة C ضيق ونعلق أنبوب جيم للdissociator مع الغطاء لأسفل. السلطة حتى dissociator. لمدة 1-2 الطحال ، حدد m_spleen_01 البرنامج. البرنامج سوف يستغرق 56 ثانية لإكمال. إذا كان عدد الطحال هو أكبر ، واستخدام برنامج m_spleen_04 ، ويمكن استخدام هذا البرنامج لمدة تصل إلى 720 ملغ من نسيج الطحال. بعد الانتهاء من برنامج نسيج الطحال الأم هي نأت الى تعليق خلية طحالية. تدور باستمرار تعليق خلية كاملة في 300xg في درجة حرارة الغرفة لمدة حوالي 30 ثانية. وهذا ضمان الافراج عن الدوار والجزء الثابت من كافة الخلايا التي يتم جمعها في الجزء السفلي من أنبوب C. إزالة عينة عن طريق فتح الحاجز مختومة في سقف الأنبوبة باستخدام C pipetter ميكروليتر 1000. خطوة الترشيح بدء الخطوة الترشيح ، وتطبيق فصل الأنسجة إلى تصفية ما قبل الانفصال أو مصفاة مع حجم الخلية 30 ميكرومتر المسام. يجب أن تتناسب مع أنبوب مصفاة 15 مليلتر لمدة 1-2 الطحال أو أنبوب 50 مل لأكثر من 2 الطحال. ترك التعليق الخلية بالمرور. ثم يغسل التصفية من خلال تطبيق 5 مل من العازلة. الآن ، وأجهزة الطرد المركزي في أنبوب مع تعليق خلية في 300xg ، في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة لجمع كل splenocytes في الطحال بيليه الخلية. الآن ، ان لدينا من بيليه splenocytes فصلها ، يجب علينا أن نضح في وطاف بيليه resuspend في خلية في مبلغ مناسب للالعازلة. سوف تفارق الطحال باستخدام Dissociator gentleMACS العائد على نسبة عالية من splenocytes قابلة للحياة ، وهو ما يتضح من التدفق الخلوي باستخدام محلل MACSQuant. هي ملطخة الخلايا الميتة التي يوديد propidium. في المثال المقدمة ، مبعثر الجانب قدما مؤامرة نقطة يبين splenocytes المعدة.

Discussion

لتجنب dissociations دليل شاقة ومؤلمة في كثير من الأحيان ، وDissociator gentleMACS يسمح احد لفصل الأنسجة بكفاءة عالية في ظل ظروف رقابة واستنساخه. الإجراء تفارق مهادنا لأنسجة الخلايا والخلايا تعليق الغلة مع بقاء معدل مرتفع. تم تصميم Dissociator gentleMACS بالاشتراك مع جيم أنابيب لإعداد وحيدة الخلية تعليق من الأنسجة المختلفة. وقد تم تجهيز هذا الصك مع عدد من قبل مجموعة برامج لفصل الماوس الطحال والكبد والرئة ، أو الأنسجة العصبية. ستكون مجموعة من البرامج والبروتوكولات يتوسع ليشمل الأنسجة الإضافية.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
gentleMACS™ Starting Kit		Miltenyi Biotec	130-093-235	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx
C Tubes		Miltenyi Biotec	130-093-237	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx
13 mL Tubes		Miltenyi Biotec	130-091-596	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx
autoMACS™ Rinsing Solution		Miltenyi Biotec	130-091-222	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx
MACS® BSA Stock Solution		Miltenyi Biotec	130-091-376	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx
Pre-Separation Filters		Miltenyi Biotec	130-041-407	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx
MACSQuant Analyzer		Miltenyi Biotec	130-092-197
Propidium Iodide Solution		Miltenyi Biotec	130-093-233	http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx