Фото-индуцированные сшивание Немодифицированные Белки (PICUP) Применительно к амилоидогенный пептиды
Summary
Фотоиндуцированные сшивания немодифицированных белков (PICUP) позволяет характеристика олигомер распределение по размерам в метастабильных смесей белков. Мы демонстрируем применение PICUP-три представителя амилоидогенный пептиды, 40 – и 42-остаток форм амилоидных β-белок, и кальцитонин, а также контроль пептидных гормонов роста-рилизинг-фактора.
Abstract
Сборка амилоидогенный белков в токсических олигомеров является знаковым событием в патогенезе неправильного фолдинга белков заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, Паркинсона, болезни Гентингтона, наследственный боковой амиотрофический склероз и сахарный диабет 2 типа. Благодаря метастабильных природу этих белков сборки, трудно оценить их распределение по размерам олигомер количественно с использованием классических методов, таких как электрофорез, хроматография, флуоресценция, или динамического рассеяния света. Олигомеров амилоидогенный белки существуют в виде метастабильных смесей, в которых олигомеров распадаются на мономеры и объединяться в большие сборки одновременно. PICUP стабилизирует олигомер населения путем ковалентного сшивания и в сочетании с фракционирования методы, такие как додецилсульфата натрия полиакриламидном геле (SDS-PAGE) или гель-хроматографии (SEC), PICUP предоставляет снимки распределения олигомеров размера, который существовал до креста сшивания. Таким образом, PICUP позволяет визуализации и количественного анализа метастабильных популяции белок и может быть использован для контроля сборки и расшифровать отношения между последовательностью изменений и олигомеризации<sup> 1</sup>. Механистически, PICUP включает в себя фото-окисления Ru<sup> 2 +</sup> В трис (бипиридил) Ru (II) комплекс (RuBpy) для Ru<sup> 3 +</sup> При облучении видимым светом в присутствии акцептора электрона. Ru<sup> 3 +</sup> Является сильным одноэлектронного окислителя способна абстрагирование электрон из соседней молекулы белка, производя белок радикальных<sup> 1,2</sup>. Радикалы нестабильны, высоко-активных форм и, следовательно, быстро исчезают с помощью различных внутри-и межмолекулярных реакций. Радикал может использовать высокую энергию непарный электрон взаимодействует с другим белком мономера формированию димерных радикал, который впоследствии теряет атом водорода и образует стабильный, ковалентно-связанных димеров. Димера может затем реагировать далее через подобный механизм с мономерами или других димеров для формирования более высокого порядка олигомеров. Преимущества относительной PICUP другим фото-или химического сшивания методы<sup> 3,4</sup> Включает короткие (≤ 1 с) воздействия неразрушающего видимый свет, нет необходимости<i> Предварительно факто</i> Модификация родной последовательности, а нулевой длины ковалентной сшивки. Кроме того, PICUP позволяет сшивки белков в широком рН и температур, в том числе физиологические параметры. Здесь мы демонстрируем применение PICUP для сшивания трех амилоидогенный белков 40 – и 42-остаток амилоидных β-белковые варианты (Aβ40 и Aβ42), а также кальцитонин, и контроль белка, рост гормона рилизинг-фактора (ГРФ).
Protocol
Discussion
PICUP была разработана первоначально для изучения устойчивые комплексы белка 2. Метод был применен позже количественное исследование метастабильных амилоидных белков собраний, в том числе Ар 10, прионных болезней и связанных PrP Sc 11 и α-синуклеина 12. Наиболее важными факторами,…
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами AG027818 и AG030709 из NIH / НИА, 2005/2E от Ларри Л. Hillblom Фонда IIRG-07-58334 от болезни Альцгеймера Ассоциации, а 07-65798 от Калифорнийского департамента здравоохранения.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Other | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp does not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Other | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Other | Kimble Chromatography | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercaptoethanol | Reagent | Sigma | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Other | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
References
- Bitan, G. Structural study of metastable amyloidogenic protein oligomers by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. Methods Enzymol. 413, 217-236 (2006).
- Fancy, D. A., Kodadek, T. Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 6020-6024 (1999).
- Kluger, R., Alagic, A. Chemical cross-linking and protein-protein interactions—a review with illustrative protocols. Bioorg. Chem. 32, 451-472 (2004).
- Tomohiro, T., Hashimoto, M., Hatanaka, Y. Cross-linking chemistry and biology: development of multifunctional photoaffinity probes. Chem. Rec. 5, 385-395 (2005).
- Bitan, G., Fradinger, E. A., Spring, S. M., Teplow, D. B. Neurotoxic protein oligomers—what you see is not always what you get. Amyloid. 12, 88-95 (2005).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Preparation of aggregate-free, low molecular weight amyloid-β for assembly and toxicity assays. Methods Mol. Biol. 299, 3-9 (2005).
- Bitan, G., Lomakin, A., Teplow, D. B. Amyloid β-protein oligomerization: prenucleation interactions revealed by photo-induced cross-linking of unmodified proteins. J. Biol. Chem. 276, 35176-35184 (2001).
- Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 330-335 (2003).
- Hepler, R. W., Grimm, K. M., Nahas, D. D., Breese, R., Dodson, E. C., Acton, P., Keller, P. M., Yeager, M., Wang, H., Shughrue, P., Kinney, G., Joyce, J. G. Solution state characterization of amyloid β-derived diffusible ligands. Biochemistry (Mosc). 45, 15157-15167 (2006).
- Bitan, G., Teplow, D. B. Rapid photochemical cross-linking—a new tool for studies of metastable, amyloidogenic protein assemblies). Acc. Chem. Res. 37, 357-364 (2004).
- Piening, N., Weber, P., Hogen, T., Beekes, M., Kretzschmar, H., Giese, A. Photo-induced crosslinking of prion protein oligomers and prions. Amyloid. 13, 67-77 (2006).
- Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. The early events of α-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking. Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).
- Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking. Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).
