Horizontale Snijd Voorbereiding van de Retina
Summary
Traditioneel worden de verticale doorsnede en de hele-mount voorbereiding van het netvlies zijn gebruikt om de functie van het netvlies circuits te bestuderen. We beschrijven hier de nieuwe snijden methode om de dendritische morfologie van het netvlies neuronen intact te behouden.
Abstract
Traditioneel worden de verticale doorsnede en de hele-mount voorbereiding van het netvlies zijn gebruikt om de functie van het netvlies circuits te bestuderen. Echter, veel van retinale neuronen, zoals amacrine cellen, horizontaal uit te breiden hun dendrieten, zodat de morfologie van de cellen wordt verondersteld te zwaar beschadigd in de verticale plakjes. In de hele-mount voorbereiding, in het bijzonder voor patch-clamp opnames, retinale neuronen in de middelste laag zijn niet gemakkelijk toegankelijk zijn als gevolg van de uitgebreide dekking van de glia cel (Mueller cel) s endfeets. We beschrijven hier de nieuwe snijden methode om de dendritische morfologie van het netvlies neuronen intact te behouden. De slice is horizontaal gemaakt op de binnenste laag van het netvlies met behulp van een vibratome slicer na het netvlies was ingebed in de lage temperatuur smeltende agarosegel. In deze horizontale plak de voorbereiding van het netvlies, bestudeerden we de functie van retinale neuronen in vergelijking met hun morfologie, met behulp van patch-clamp-opname, calcium beeldvormende techniek, immunocytochemie, en single-cell RT-PCR.
Protocol
Discussion
Er zijn een aantal belangrijke voordelen van de horizontale plak voorbereiding van het netvlies.
Eerste, is de morfologie van de cellen die dendrieten uit te breiden horizontaal, zoals amacrine cellen en horizontale cellen, bewaard gebleven. Het is aangetoond dat er meer dan 20 soorten amacrine cellen in het netvlies (MacNeil en Masland, 1998), zodat het is heel belangrijk voor de morfologie van de cellen te vergelijken met de fysiologische eigenschap.
Ten tweede, in de hele-mount netvlies, de uitgebreide dekking van endfeet…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Drs. Richard H. Masland en Akimichi Kaneko voor het geven van ons waardevolle adviezen en suggesties om de procedure van de horizontale plak voorbereiding van het netvlies vast te stellen.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agar | Sigma | A-1296 | ||
| Agarose L | Wako | 317-01182 | Low-temperature melting agarose | |
| Hyaluronidase | Sigma | Type I-S, 300 units/mg | ||
| Medium | in mM: 102 NaCl, 3.1 KCl, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3, and 10 glucose, maintained at pH 7.8, or, Ames’ Solution (Sigma) | |||
| Microwave | ||||
| Hot water bath | 35 C | |||
| Vibratome slicer | Leica | VT1000S | ||
| MF-Membrane filters | Millipore | HAWP01300 | Filter paper , pore size 0.45 um | |
| Dissection tools | forceps, blade, pinch, twizzer, etc. | |||
| Instant glue | eg., Alonalpha, Krazy Glu | |||
| 50 ml syringe | ||||
| syringe filter | Millipore | SX0001300 |
References
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A., Koizumi, A., TC, J. a. k. o. b. s., Masland, R. H., MA, M. a. c. N. e. i. l., RH, M. a. s. l. a. n. d. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
