Immagini dal vivo di Dense-core Vescicole nella Primaria neuroni coltivati ippocampale
Summary
L'imaging cellulare Live è di particolare utilità quando si studiano le dinamiche del traffico di organelli. Qui si descrive un protocollo per l'imaging dal vivo di denso-core vescicole in neuroni coltivati con grande campo microscopia a fluorescenza. Questo protocollo è flessibile e può essere adattato a organelli altra immagine come i mitocondri, endosomi e perossisomi.
Abstract
L'osservazione e la caratterizzazione dinamica dei processi cellulari può fornire informazioni importanti sulle attività cellulare che non possono essere acquisite immagini statiche. Vital sonde fluorescenti, in particolare proteina fluorescente verde (GFP) hanno rivoluzionato la biologia delle cellule che derivano dalla capacità di etichetta specifici comparti intracellulari e strutture cellulari. Per esempio, l'immagine dal vivo di GFP (e le sue varianti spettrale) chimere hanno permesso un'analisi dinamica del citoscheletro, il trasporto degli organelli, e le dinamiche della membrana in una moltitudine di organismi e di tipi di cellule [1-3]. Sebbene l'imaging dal vivo è diventata prevalente, questo approccio pone ancora molti problemi tecnici, in particolare nella scuola primaria neuroni coltivati. Una sfida è l'espressione di proteine GFP-tagged in post-mitotico neuroni, l'altro è la capacità di catturare immagini a fluorescenza, riducendo al minimo fototossicità, photobleaching, e mantenere la salute generale delle cellule. Qui forniamo un protocollo che descrive un metodo a base di lipidi transfezione che produce un tasso di trasfezione relativamente basso (~ 0,5%), è tuttavia ideale per l'imaging di neuroni completamente polarizzata. Un tasso di trasfezione basso è essenziale in modo che gli assoni e dendriti singolo può essere caratterizzato da loro orientamento verso il corpo cellulare per confermare la direzionalità di trasporto, cioè, anterograda v. retrograda. Il nostro approccio all'imaging GFP che esprimono i neuroni si basa su uno standard a grande campo microscopio a fluorescenza equipaggiato con una telecamera CCD, software per la cattura delle immagini, e una camera di imaging riscaldata. Abbiamo immaginato una grande varietà di organelli o strutture, ad esempio, densi-core vescicole, mitocondri, coni di crescita, e actina senza ottica o esigenze particolari di eccitazione che non sia un fonte di luce fluorescente. Inoltre, spettralmente-distinte, proteine fluorescente, ad esempio, GFP-tagged DsRed e proteine, possono essere visualizzati simultaneamente vicino a caratterizzare co-trasporto o altri eventi coordinati cellulare. L'approccio di imaging qui descritto è flessibile per una varietà di applicazioni di imaging e può essere adottata da un laboratorio per il costo relativamente poco fornito un microscopio è disponibile.
Protocol
Discussion
L'imaging cellulare dal vivo è una tecnica difficile, ma potente per l'osservazione diretta del trasporto degli organelli nei neuroni in coltura. Le difficoltà possono sorgere a monte della procedura con la salute dei neuroni poveri a causa di complicazioni cultura. Di conseguenza, la salute delle cellule (per esempi vedi rif. 4) deve essere valutata prima e dopo la trasfezione osservando i coprioggetti mentre nel mezzo di crescita mediante una cultura microscopio dei tessuti leggeri. Il processo di trasferime…
Acknowledgements
Ringraziamo Harald Hutter e Helena Decker per la loro attenta lettura di questo manoscritto. Ringraziamo anche Reg. Sidhu di Leica Microsystems per la sua competenza tecnica. Questa ricerca è stata sostenuta dalla Scienze e Ingegneria del Consiglio Nazionale del Canada, Premio # 327100-06, e la Simon Fraser Facoltà Universitaria di Scienze.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| MEM-Eagle with Earle salts and L-glutamine | Reagent | Mediatech | 10-010-CV | |
| Lipofectamine 2000 | Reagent | Invitrogen | 11668-027 | Transfection reagent |
| 10X Hanks with Ca2+ and Mg2+ | Reagent | Gibco/Invitrogen | 14185-052 | Live-imaging medium |
| 1M HEPES | Reagent | Gibco/Invitrogen | 15630-130 | Live-imaging medium |
References
- Kulic, I. M., et al. The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).
- Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon. Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).
- Barkus, R. V., et al. Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides. Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).
