Deze film en het protocol zijn bedoeld om te leren nucleaire transfer.
Abstract
Kernenergie te zetten in een onbevruchte eicel kan herstellen ontwikkelingsstoornissen potentieel om een gedifferentieerde cel. Dit toont aan dat de processen die ten grondslag liggen ontwikkeling, differentiatie en veroudering zijn epigenetische in plaats van genetische processen. De omkeerbaarheid van deze processen opent opwindende perspectieven in fundamenteel onderzoek, en in de verdere toekomst, in de regeneratieve geneeskunde. In de muis, kunnen embryonale stamcellen worden afgeleid uit gekloonde embryo's pre-implantatie fase. Dergelijke embryonale stamcellen hebben het vermogen om aanleiding te geven tot alle celtypes van het volwassen organisme. Belangrijk is dat deze cellen zijn genetisch identiek aan de donor. Indien van toepassing op de mens, zou dit mogelijk de winning van stamcellen uit een patiënt. Deze cellen kunnen vervolgens worden onderverdeeld in de getroffen celtype van de patiënt en bestudeerd in vitro, of worden gebruikt om de beschadigde of ontbrekende cellen te vervangen. De studie van nucleaire transfer in de muis blijft belangrijk want het kan ons informeren over de principes van de nucleaire herprogrammering. Deze film en de bijbehorende protocol zijn bedoeld om het leren nucleaire transfer in de muis, een methode in eerste instantie ontwikkeld in de groep van prof. dr. Yanagimachi (Wakayama et al.. 1998).
Protocol
Voorbereidingen: Een gedetailleerde beschrijving van superovulatie en MicroDrop embryo cultuur kunnen elders 2 te vinden. Bereid een petrischaal met microdruppels van embryo cultuur medium (bijv. KSOM, Chemicon). Dek af met minerale olie (minerale olie batches moet worden getest op compatibiliteit met embryo cultuur). Evenwicht bij 37 ° C in de lucht, vermeerderd met 5% CO 2. (In Thermo Electron-3110 watermantel incubator of gelijkwaardig) <…
Discussion
Good luck!
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DE zou graag Dr Hide Akutsu bedanken voor het delen van zijn NT trucs en dr. Stephen Sullivan en Garrett Birkhoff voor de kritische lezing van het protocol.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
Cytochalastin B
Sigma
100x stock = 500 ug/mL Cytochalasin B in DMSO. Store at -20˚ C.
Strontium Chloride
10x stock = 100 mM SrCl2 in H2O. Store at room temperature.
MCZB Stock Salts
Filter sterilize 500 mL master salts (good for 3-4 months; store at 4˚ C)
HCZB Stock Salts
Start with 500 mL master salts. Add 50 mg PVA. Stir for 30-60 min and sterile filter (good for 3 months; store at 4˚ C).
PVA
Sigma
P-8136
cold-soluble
HCZB with 11% w/v PVP
Start with 20 ml HCZB medium in a 50 mL conical tube. Place 22g PVP on top of liquid. Close tube and store undisturbed at 4˚ C for 72 – 96 hrs, at which time the PVP will have entered solution. Filter sterilize through an 8 mm filter and store at 4˚ C.
PVP
ICN Biochemicals
MW 360000
Please check for additional buffers compositions in the Protocol part.