Visualisering antigenspecifikt CD4 + T celler med MHC klass II Tetramers

Summary

Detta förfarande visar på rening och in vitro utbyggnad av antigen CD4 + T-celler från hela perifert blod och visualisering med hjälp av MHC klass II tetramers. Tetramers tillåter direkt visualisering av T-celler med en enda antigenspecificitet och definieras MHC klass II begränsning.

Abstract

Stora histocompatibility komplex (MHC) klass II tetramers tillåter direkt visualisering av antigen CD4 + T-celler med flödescytometri. Denna metod förlitar sig på den mycket specifika interaktionen mellan peptid laddas MHC och motsvarande T-cells receptorn. Medan affinitet av en enda MHC / peptid molekylen är låg, tvärbindande MHC / peptid komplex med streptavidin ökar aviditet av samverkan, vilket gör att de används som färgning reagenser. På grund av den relativt låga frekvenser av CD4 + T-celler (~ 1 på 300 tusen för en enda specificitet) denna analys använder en in vitro amplifieringssteg att öka sin tröskel för upptäckt. Mononukleära celler renas från perifert blod med Ficoll underlag. CD4 + celler separeras därefter genom negativa val med biotinylerad antikropp cocktail och anti-biotin märkt magnetiska kulor. Använda anhängare celler från CD4-celler delen som antigenpresenterande celler, CD4 + T-celler utvidgas i media genom att lägga till en antigen peptid och IL-2. Den utökade cellerna färgas med motsvarande klass II tetramer genom att inkubera vid 37 ° C i en timme och sedan färgas med yta antikroppar som anti-CD4, anti-CD3 och anti-CD25. Efter märkning kan cellerna direkt analyseras med flödescytometri. Den tetramer positiva celler bildar oftast en distinkt population bland de utökade CD4 + celler. Tetramer positiva celler är oftast CD25 + och ofta CD4 hög. Eftersom nivån av bakgrunden tetramer färgning kan variera, bör positiv färgning resultat alltid jämföras med färgning av samma celler med en irrelevant tetramer. Flera varianter av denna grundläggande analys är möjliga. Tetramer positiva celler kan sorteras för vidare fenotypisk analys, ingå i ELISPOT eller analyser spridning eller andra sekundära analyser. Flera grupper har också visat co-färgning hjälp tetramers och antingen mot cytokin eller anti-FOXP3 antikroppar.

Protocol

1. Perifera mononukleära celler (PBMC) isolering Skaffa ett blodprov – Blod ska samlas i sprutor eller rör blod och anti-koagulerat med heparin (1:50 ratio) för att förhindra koagulering. Räkna med en avkastning på ca 1 × 10 6 PBMC per ml blod – cirka 40% av dessa kommer att CD4-positiva (CD4 +) T-celler. Alikvotera blodet i 50 ml koniska rör, 25 ml per rör. Om blod har separerat, blanda försiktigt innan alikvotering att distribuera plasma Tillsätt PBS, vilket den tot…

Discussion

Att förstå betydelsen av CD4 + T-celler i immunitet är av grundläggande betydelse. Däremot kan antigen CD4 + T-celler vara svårt att upptäcka och isolera med traditionella metoder. Däremot MHC klass II tetramers möjligt att direkt visualisering av CD4 + T-celler med önskad antigenspecificitet. Denna video visar isolering, rening, och in vitro amplifiering av CD4 + T-celler och deras efterföljande visualisering med hjälp tetramers. Klass II Tetramers är fluorescerande protein konjugat som består av lösliga…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Class 2 Laminar flow biosafety cabinet	equipment	Thermo Forma	1200	Or equivalent
50 mL conical Tube	equipment	VWR	47747-182	Or equivalent
1X PBS (Ca/Mg free)	Reagent	HyClone	SH30028.02	Or equivalent
Ficoll-paque PLUS	Reagent	GE Healthcare	17-1440-03	foil wrapped to protect from light
Pipet Aid XP	equipment	Drummond	4-000-101	Or equivalent
10 mL pipet	equipment	Corning/Costar	CLS4492	Or equivalent
Aerosolve Canisters	equipment	Beckman	359481	with 50 mL inserts
Centrifuge	equipment	Beckman	GS-6R	Or equivalent
Transfer pipets	equipment	Samco	202-20S	Or equivalent
Pasteur pipets	equipment	VWR	14672-200	Or equivalent
Hemolytic Buffer	Reagent	N/A	N/A	8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA
Trypan blue	Reagent	Sigma	T6146	0.2% in PBS
Hemocytometer	equipment	VWR	15170-208
15 mL conical tube	equipment	VWR	05-527-90	Or equivalent
Running Buffer	Reagent	N/A	N/A	PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA
MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II	Reagent	Miltenyi Biotec	130-091-155	Or equivalent
EasySep® Magnet	equipment	Stem Cell Technologies	18000
5 mL polypropylene tube	equipment	Falcon	352063
RPMI 1640	Reagent	Invitrogen	22400-089	with 25 mM HEPES
Pooled human serum	Reagent	N/A	N/A	drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered
Pen Strep	Reagent	Invitrogen	1570-063	Or equivalent
500mL 0.22 micron bottle top filter	equipment	Nalgene	595-3320	Or equivalent
48-well plate	equipment	Costar	3548	Or equivalent
37°C CO2 incubator	equipment	Sanyo Scientific	MCO-18AIC	Or equivalent
20 mg/mL synthetic peptide	Reagent	N/A	N/A	Custom synthesis from any peptide vendor
5 mL FACS tube	equipment	Falcon	352008	Polystyrene
Peptide loaded class II tetramer (as described)	Reagent	N/A	N/A	Prepared by the BRI tetramer core
Anti-CD3	Reagent	BD pharmingen	347344	Or equivalent
Anti-CD4	Reagent	eBioscience	17-0049-73	Or equivalent
Anti-CD25	Reagent	eBioscience	11-0259-73	Or equivalent
Facs Calibur Flow Cytometer	equipment	BD Biosciences	342975	Or equivalent