Dieses Verfahren zeigt die Reinigung und in vitro Expansion von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen aus ganzen peripheren Blut und deren Visualisierung mit Hilfe der MHC-Klasse II Tetramere. Tetramere erlauben die direkte Visualisierung von T-Zellen mit einem einzigen Antigen-Spezifität und definierte MHC-Klasse II Einschränkung.
Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse II Tetramere erlauben die direkte Visualisierung von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode basiert auf der hoch spezifische Wechselwirkung zwischen Peptid beladenen MHC und die entsprechenden T-Zell-Rezeptor. Während die Affinität eines einzelnen MHC / Peptid-Molekül ist gering, Vernetzung MHC / Peptid-Komplexe mit Streptavidin erhöht die Avidität der Interaktion, so dass ihre Verwendung als Färbereagenzien. Wegen der relativ niedrigen Frequenzen von CD4 + T-Zellen (~ 1 in 300.000 für einen einzigen Spezifität) diesen Test nutzt eine in vitro-Amplifikation Schritt zu seiner Schwelle Erkennung zu erhöhen. Mononukleären Zellen aus dem peripheren Blut durch Ficoll Unterlage gereinigt. CD4 + Zellen werden dann durch negative Selektion mittels biotinylierten Antikörper-Cocktail und anti-Biotin markiert magnetische Kügelchen getrennt. Mit adhärenten Zellen aus der CD4-Zell-Fraktion als Antigen-präsentierende Zellen, CD4 + T-Zellen werden in Medien, indem eine antigene Peptid-und IL-2 erweitert. Die expandierten Zellen sind mit der entsprechenden Klasse II Tetramer durch Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde und anschließend gefärbt mit Oberfläche Antikörper wie anti-CD4, anti-CD3 und anti-CD25 gefärbt. Nach der Etikettierung können die Zellen direkt mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. Das Tetramer-positiven Zellen bilden typischerweise eine deutliche Bevölkerung unter den erweiterten CD4 +-Zellen. Tetramer-positiven Zellen sind in der Regel CD25 + CD4 und oft hoch. Da der Pegel der Hintergrundgeräusche Tetramer-Färbung kann variieren, sollten positive Färbung Ergebnisse immer auf die Färbung von den gleichen Zellen mit einem irrelevanten Tetramer verglichen werden. Mehrere Variationen dieses grundlegende Assay sind möglich. Tetramer-positive Zellen können für weitere phänotypische Analyse, Aufnahme in ELISPOT oder Proliferation Assays oder andere sekundäre Assays sortiert werden. Mehrere Gruppen haben auch Co-Färbung mit Tetrameren und entweder Anti-Zytokin-oder Anti-FoxP3 Antikörper nachgewiesen.
Verständnis der Rolle der CD4 + T-Zellen im Immunsystem ist von grundlegender Bedeutung. Allerdings können Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen schwer zu erkennen und zu isolieren, die mit traditionellen Methoden. Im Gegensatz dazu erlauben MHC-Klasse-II-Tetramere die direkte Visualisierung von CD4 + T-Zellen mit der gewünschten Antigen-Spezifität. Dieses Video zeigt die Isolierung, Reinigung und In-vitro-Amplifikation von CD4 + T-Zellen und deren anschließende Visualisierung mit Tetrameren. Klasse II Tetramere sind…
Wir danken Dick Foley und Leigh Kimball für ihre Schlüsselrolle bei der Film-und Videoproduktion.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Class 2 Laminar flow biosafety cabinet | equipment | Thermo Forma | 1200 | Or equivalent |
50 mL conical Tube | equipment | VWR | 47747-182 | Or equivalent |
1X PBS (Ca/Mg free) | Reagent | HyClone | SH30028.02 | Or equivalent |
Ficoll-paque PLUS | Reagent | GE Healthcare | 17-1440-03 | foil wrapped to protect from light |
Pipet Aid XP | equipment | Drummond | 4-000-101 | Or equivalent |
10 mL pipet | equipment | Corning/Costar | CLS4492 | Or equivalent |
Aerosolve Canisters | equipment | Beckman | 359481 | with 50 mL inserts |
Centrifuge | equipment | Beckman | GS-6R | Or equivalent |
Transfer pipets | equipment | Samco | 202-20S | Or equivalent |
Pasteur pipets | equipment | VWR | 14672-200 | Or equivalent |
Hemolytic Buffer | Reagent | N/A | N/A | 8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA |
Trypan blue | Reagent | Sigma | T6146 | 0.2% in PBS |
Hemocytometer | equipment | VWR | 15170-208 | |
15 mL conical tube | equipment | VWR | 05-527-90 | Or equivalent |
Running Buffer | Reagent | N/A | N/A | PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA |
MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II | Reagent | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | Or equivalent |
EasySep® Magnet | equipment | Stem Cell Technologies | 18000 | |
5 mL polypropylene tube | equipment | Falcon | 352063 | |
RPMI 1640 | Reagent | Invitrogen | 22400-089 | with 25 mM HEPES |
Pooled human serum | Reagent | N/A | N/A | drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered |
Pen Strep | Reagent | Invitrogen | 1570-063 | Or equivalent |
500mL 0.22 micron bottle top filter | equipment | Nalgene | 595-3320 | Or equivalent |
48-well plate | equipment | Costar | 3548 | Or equivalent |
37°C CO2 incubator | equipment | Sanyo Scientific | MCO-18AIC | Or equivalent |
20 mg/mL synthetic peptide | Reagent | N/A | N/A | Custom synthesis from any peptide vendor |
5 mL FACS tube | equipment | Falcon | 352008 | Polystyrene |
Peptide loaded class II tetramer (as described) | Reagent | N/A | N/A | Prepared by the BRI tetramer core |
Anti-CD3 | Reagent | BD pharmingen | 347344 | Or equivalent |
Anti-CD4 | Reagent | eBioscience | 17-0049-73 | Or equivalent |
Anti-CD25 | Reagent | eBioscience | 11-0259-73 | Or equivalent |
Facs Calibur Flow Cytometer | equipment | BD Biosciences | 342975 | Or equivalent |