Vaccinia Virüs Enfeksiyonu & Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Bölüm 1
Summary
Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. Part 1 3.
Abstract
Aile<em> Poxviridae</em> Sadece enfekte hücrelerin sitoplazmasında çoğaltmak virüsler içeren büyük çift iplikli DNA oluşur. Üyeleri<em> Orthopox</em> Cinsine dahil variola, insan küçük çiçeği etkeni, monkeypox ve vaccinia (VAC), virüs aile prototipik üyesi. Göreceli olarak büyük (~ 200 kb) vaccinia genom içinde gen üç sınıfa kodlanır: erken, orta ve geç. Her üç sınıf, viral kodlanmış RNA polimeraz tarafından transkripsiyonu olsa da, her sınıf, virüsün yaşam döngüsü içinde farklı bir fonksiyon sunar. Poxviruses enfeksiyon sırasında ev sahibi hücresel ortamı modülasyonu için çoklu stratejiler kullanmaktadır. Hem ev sahibi hem virüs gen ekspresyonu düzenlenmesi anlamak için, biz, hem virüs ve konak hücrelerine transkript bolluk analiz etmek için genom yaklaşımlar kullanılmaktadır. Burada, birkaç saat sonrası enfeksiyon Vaccinia virüs ve örnekleme RNA HeLa hücrelerinde zaman ders enfeksiyonları göstermektedir. Her iki konak ve viral toplam RNA gen ekspresyonu analizi için mikroarray'ler hibridizasyon için izole edilmiş ve yükseltilir.
Protocol
Discussion
Kritik Adımlar
Part 1 & 2
Senkron vaccinia enfeksiyonu kurma pek çok kritik adımlar vardır, virüsün ilk olmanın dikkatli sonication (veya trypzinizing), virüs parçacıkları parçalara ayırma için. Vaccinia toplayarak için son derece eğilimli ve virüs parçacıkları bozulması hücre bile enfeksiyon sağlamak için önemlidir. Senkron bir enfeksiyon ulaşmak için (2'den fazla), İçişleri Bakanlığı, her bir hücre enfekte yüksek sağlamak …
Acknowledgements
Whitehead Enstitüsü'nden Fellows Fonları
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| TRIzol Reagent | Reagent | Invitrogen | 15596-026 | Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work. |
| BCP Phase Separation Reagent | Reagent | Molecular Research Center | BP151 | |
| RNase-Free DNase Set | Reagent | Qiagen | 79254 | DNase treatment is an optional step. |
References
- KH, R. u. b. i. n. s., LE, H. e. n. s. l. e. y., GW, B. e. l. l., Wang, C., EJ, L. e. f. k. o. w. i. t. z., PO, B. r. o. w. n., DA, R. e. l. m. a. n. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).
- Satheshkumar, P. S., Moss, B. Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells. J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells. J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).
- Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells. J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).
- Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., JM, G. a. t. e. l. l., Gallart, T., Esteban, M. Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC. 81 (16), 8707-8721 (2007).
