Protocole pour la vaccine infection de cellules HeLa et l'analyse de l'hôte et l'expression des gènes viraux.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Infection virus de la vaccine et l'analyse temporelle de l'expression des gènes de virus: Partie 2
Dans cet article
Résumé
Résumé
La famille
Protocole
Partie 1: synthèse de l'ADNc de l'ARN
- Avant d'utiliser le Ambion Amino Allyl MessageAmp II kit, ajouter la quantité recommandée d'éthanol à 100% pour les tampons de lavage.
- Dans le tube de réaction PCR, ajouter entre 100 ng d'ARN total de 5 ug et 1 microlitre de T7 oligo (dT) primer. Porter le volume à 12μl avec une eau sans nucléase.
- Incuber les échantillons à 70 ° C pendant 10 min dans un thermocycleur.
- Retirer les échantillons d'ARN à partir de 70 ° C et centrifuger brièvement. Placez-le sur la glace.
- Préparer le 1 er volet de synthèse master mix et de conserver à température amb....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Étapes critiques
Un second tour de l'amplification n'est pas conseillé que des biais dans les données array ont été observées. Mélanger soigneusement à chaque étape enzymatique (1 er et 2 ème synthèse brin d'ADNc, IVT) est essentielle à l'obtention de rendements d'amplification bon, tout comme l'incubation de chaque étape enzymatique à la température appropriée. Un cycleur PCR avec couvercle chauffant réglable est préféré - les écarts, même aussi p.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Remerciements
Whitehead Institute Fellows Fonds
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| Kit d'amplification d'ARNm Amino Allyl MessageAmp II | Réactif | Applied Biosystems | AM1753 | Pour 20 réactions |
| Kit d'amplification d'ARNm Amino Allyl MessageAmp II | Réactif | Applied Biosystems | AM1821 | Pour 100 réactions, au format 96 puits |
| Spectrophotomètre UV-VIS NanoDrop ND-1000 | Autre | NanoDrop | ND-1000 | Ou spectrophotomètre équivalent |
Références
- Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes. PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).
- Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickso....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
