Le test MTT est un test simple et reproductible colorimétriques pour l'évaluation de la viabilité cellulaire basé sur la réduction du MTT jaune et la production d'eau formazan violet insoluble. Ici, la viabilité des cellules MCF-7 sur le traitement des nanogenomedicine a été évalué.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Toxicité cellulaire des Nanogenomedicine dans la lignée cellulaire MCF-7: test MTT
Dans cet article
Résumé
Résumé
La cytotoxicité de l'nanogenomedicine futuristes (par exemple, petits ARN interférents et antisens) peuvent entraver son développement clinique. Parmi ces derniers, la médecine fondée sur les gènes et / ou son transporteur peut susciter une toxicité cellulaire. Pour l'évaluation de la cytotoxicité telle, une méthodologie commune est largement tributaire de l'utilisation de la 3 - (4, 5-diméthyl-2-thiazolyl) -2, 5-diphényl-2H-tétrazolium (MTT) qui a été largement utilisé comme une approche colorimétrique basé sur l'activité des enzymes déshydrogénases mitochondriales dans les cellules. Dans cette enquête, cellules MCF-7 ont été inoculés dans plaque de 96 puits et à 50% de confluence, ils ont été traités avec nanopolyplexes différents et soumis à des test MTT après 24 heures. Eau MTT solubles jaune est métabolisé par les cellules métaboliquement actives pour le formazan violet insoluble dans l'eau, qui est encore dissous dans du tampon pH diméthylsulfoxyde et Sornson s 10.5. Le produit résultant peut être quantifiée par spectrophotométrie en utilisant un lecteur de plaque à 570 nm.
Protocole
MCF-7 semis en plaque de 96 puits:
Cellules MCF-7 ont été cultivées dans 25 t-ballon dans un milieu contenant Medium Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), 10% de FBS, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine à 37 ° C avec 5% de CO 2, 95% air et l'humidité complète. Une fois atteint ~ 90% de confluence, ils ont été détachés en utilisant 0,05% de trypsine / EDTA et comptées par les moyens de bleu trypan et hémocytomètre. Ces cellules ont ensuite été remises en suspension à une concentration de 4 x 10 4 cellules / cm 2 et ajouté sur plaque de 96 puits (ie, 250 ul / puits) par une pipette à 8 canaux. Pour l'absorption de fond, certains puits ont été resté sans cellule, c'est à dire que le contrôle vierge.
Traitement des cellules avec nanopolyplexes différentes:
À 40-50% de confluence (48 heures après l'ensemencement), les cellules cultivées ont été traités avec nanostructurés dendrimères polyamidoamine Starburst (ie, Superfect ® et Polyfect ®) et un polymère nouveau test en suivant les instructions fournies par le fournisseur de transfection. Les cellules ont été également traités avec EGFR et brouillés antisens seul, et avec les trois nanopolyplexes différente de ces deux oligonucléotides et par des polymères (n = 4). Quatre puits ont été n'ont pas été traités comme contrôle. Après 4 heures du traitement médiatique ont été enlevés et reconstituées avec des milieux frais.
MTT pour l'évaluation de la viabilité cellulaire:
MTT a été réalisée 24 heures après transfection. Pour ce faire, la solution de MTT a été préparé à 1mg/ml dans du PBS et a été filtré à travers un filtre de 0,2 um. Ensuite, 50 ul de MTT et 200 ul de DMEM sans rouge de phénol ont été ajoutés dans chaque puits, à l'exception des puits sans cellules vides. Les cellules ont été incubées pendant 4 heures à 37 ° C avec 5% de CO 2, 95% d'air et d'humidité complète. Après 4 heures, la solution de MTT a été enlevé et remplacé par 200 ul de DMSO et 25 pi de Sorenson tampon glycine (glycine 0,1 M, NaCl 0,1 M, pH: 10,5 à 0,1 NaOH). La plaque a été incubée pendant encore 5 min à température ambiante, et la densité optique (DO) des puits a été déterminée en utilisant un lecteur de plaque à une longueur d'onde de test de 570 nm et une longueur d'onde de référence de 630 nm.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Le test MTT est réputé être une méthode souple et donc la viabilité des cellules peut être évaluée sur divers traitements. La production de formazan résultante semble être proportionnelle au niveau du métabolisme énergétique des cellules. Par conséquent, il est possible de mesurer les cellules métaboliquement actives même en l'absence de prolifération cellulaire. La quantité de formazan produite est proportionnelle à la quantité de MTT dans le milieu d'incubation. Alors, la concentration de MTT qui est nécessair...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier technologie des cellules souches et Shahid Ghazi entreprises Tabriz, respectivement, pour fournir de l'eau DMEM sans rouge de phénol et stériles pour l'injection comme cadeaux.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Flacon T-25 | Orange Scientific | 5510100 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Milieu de Dulbecco’s modifié de Eagle’s - glucose élevé | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| MTT | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| Sérum bovin fœtal (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Pénicilline 200 000 u/ml | CinnaGen | CR7913 | |
| Streptomycine 200 mg/ml | CinnaGen | CR7912 | |
| Trypsine/EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | |
| Bleu de trypan | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Superfect | Qiagen | 301105 | |
| Polyfect | Qiagen | 301305 | |
| Antisens EGFR | Eurofins MWG Operon | ||
| Antisens aléatoire | Eurofins MWG Operon | ||
| DMEM sans rouge de phénol | GIBCO, by Life Technologies | 11880 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Hémocytomètre | HBG | ||
| Pipette 8 canaux | TreffLab Transferpette | 96.9918.10.1 | |
| Filtre à seringue jetable | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 2052-025 | |
| Lecteur de plaques équipé de filtres à 570 nm &630 nm | BioTek | ELX808 | |
| Plaque 96 puits avec couvercle (fond plat) | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | 3860-096 | |
| Pétri à flux laminaire | Esco Products | ||
| Incubateur CO2 | ASTEC |
Références
- Plumb, J. A., Milroy, R., Kaye, S. B. Effects of the pH Dependence of 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide-Formazan Absorption on Chemosensitivity Determined by a Novel Tetrazolium-based Assay. Cancer Research. 49, 4435-4435 (1989).
- Mosmann, T. Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. Journal of Lmmunological Methods. 65, 55-55 (1983).
- Yang, M. Energy and Redox States in the C6 Glioma Cells Following Acute Exposure to Zn, Se +4 , and Se +6 and the Correlation with Apoptosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 16 (1), 13-13 (2006).
- Spinner, D. M. MTT Growth Assays in Ovarian Cancer, in Ovarian Cancer: Methods and Protocols. Bartlett, J. M. S. , Humana Press, Inc. 175-177 (2000).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
