В этой статье мы представляем общий протокол для измерения диапазона репликативной жизни клеток дрожжей матери.
Abstract
Старение является дегенеративный процесс характеризуется прогрессирующей деградации клеточных компонентов и органелл в результате чего смертность. Почкующихся дрожжей<em> Saccharomyces CEREVISIAE</em> Широко используется для изучения биологии старения, а также нескольких определяющих факторов долголетия дрожжей было показано, что сохраняться в многоклеточных эукариот, в том числе червей, мух и мышей<sup> 1</sup>. Из-за отсутствия легко количественно возрасте связанных фенотипов, старения у дрожжей был почти исключительно анализировали путем измерения продолжительности жизни клеток в различных контекстах, с двумя различными жизни парадигм в обиходе<sup> 2</sup>. Хронологический продолжительность жизни относится к времени, что материнской клетки могут выживать в не-деления, покоя-подобного состояния, и ее предлагается в качестве модели для старения после делящихся клеток в многоклеточных эукариот. Промежуток репликативной жизни, напротив, относится число дочерних клеток производства материнской клетки до старости, и, как полагают, обеспечивают модели старения в митотически активных клеток. Здесь мы представляем обобщенные протокол для измерения диапазона репликативной жизни начинающего материнских клетках дрожжей. Цель анализа промежуток жизни репликативной заключается в определении того, сколько раз каждый почки материнской клетки. Мать и дочь клетки могут быть легко дифференцированы по опытный исследователь использованием стандартной световой микроскоп (общее увеличение 160X), таких как Axioscope Zeiss 40 или другой сопоставимой модели. Физическое разделение дочерних клеток от матери клетки достигается с помощью ручной микроманипулятора оснащен волоконно-оптической иглы. Типичные штаммы дрожжей лаборатории производят 20-30 дочерних клеток на одну женщину и одного продолжительность жизни эксперимент требует 2-3 недель.
Protocol
Часть 1: Подготовка штаммов и пластины для анализа репликативной продолжительности жизни В этом разделе описывается подготовка твердых YEPD пластин для использования в пролете репликативной эксперимент жизни и подготовке дрожжевых клеток для анализа жизненного диапазона. И?…
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом МК и Бангкок из Эллисон Медицинский фонд. МК Эллисон Медицинский фонд Новый ученый в процессе старения. Мы хотели бы поблагодарить Soumya Kotireddy за помощь во время съемок.
Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209, doi:10.3791/1209 (2009).