Het meten van replicatieve levensduur in de gist
Summary
In dit artikel geven we een algemeen protocol voor het meten van de replicatieve levensduur van gist moeder cellen.
Abstract
Veroudering is een degeneratieve proces wordt gekenmerkt door een progressieve verslechtering van de cellulaire componenten en organellen resulterend in sterfte. De gist<em> Saccharomyces cerevisiae</em> Is uitgebreid gebruikt om de biologie van het ouder worden bestuderen, en een aantal determinanten van gist levensduur is aangetoond dat ze worden bewaard in meercellige eukaryoten, zoals wormen, vliegen en muizen<sup> 1</sup>. Vanwege het gebrek aan gemakkelijk gekwantificeerd leeftijd-geassocieerde fenotypes, de vergrijzing in gist is bijna uitsluitend getest door het meten van de levensduur van cellen in verschillende contexten, met twee verschillende levensduur paradigma's in het gemeenschappelijk gebruik<sup> 2</sup>. Chronologische levensduur verwijst naar de lengte van de tijd dat een moeder cel kan overleven in een niet-delende, rust-achtige toestand, en is voorgesteld om te dienen als een model voor de veroudering van post-mitotische cellen in meercellige eukaryoten. Replicatieve levensduur, daarentegen, verwijst het aantal van de dochter van cellen die door een moeder cel voorafgaand aan senescentie, en wordt beschouwd als een model van het ouder worden in mitotisch actieve cellen. Hier presenteren wij een algemeen protocol voor het meten van de replicatieve levensduur van gist moeder cellen. Het doel van de replicatieve levensduur test is om te bepalen hoe vaak elke moeder cel knoppen. De moeder en dochter cellen kunnen gemakkelijk worden onderscheiden door een ervaren onderzoeker met behulp van een standaard lichtmicroscoop (totale vergroting 160X), zoals de Zeiss Axioscope 40 of een ander vergelijkbaar model. Fysieke scheiding van de dochter van cellen van de moeder van cellen is bereikt met behulp van een handleiding micromanipulator is uitgerust met een glasvezel-naald. Typische laboratorium gist stammen produceren 20-30 dochter cellen per moeder en een levensduur experiment vergt 2-3 weken.
Protocol
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie aan MK en BKK van de Ellison Medical Foundation. MK is een Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging. We willen graag Soumya Kotireddy bedanken voor hulp tijdens het filmen.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Agar | Reagent | Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems) | DF0145-17-0 (214530) | |
| Bacto-Peptone | Reagent | Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems) | DF0118-17-0 (211677) | |
| Yeast Extract | Reagent | Fisher Scientific (BD Diagnostic Systems) | DF0886-17-0 (288620) | |
| Glucose |
References
- Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. Recent developments in yeast aging. PLoS Genet. 3, (2007).
- Kaeberlein, M., Conn, P. M. . Handbook of models for human aging. , 109-120 (2006).
- Smith, E. D. Quantitative evidence for conserved longevity pathways between divergent eukaryotic species. Genome Res. 18, 564-570 (2008).
- Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Replicative aging in yeast: the means to the end. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29-54 (2008).
- Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63, 113-121 (2008).
- Jiang, J. C., Jaruga, E., Repnevskaya, M. V., Jazwinski, S. M. An intervention resembling caloric restriction prolongs life span and retards aging in yeast. Faseb J. 14, 2135-2137 (2000).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Sir2-independent life span extension by calorie restriction in yeast. PLoS Biol. 2, E296-E296 (2004).
- Lin, S. J., Defossez, P. A., Guarente, L. Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae. Science. 289, 2126-2128 (2000).
- Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes. Mech Ageing Dev. 126, 17-21 (2005).
- Kaeberlein, M. Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients. Science. 310, 1193-1196 (2005).
