IVISスペクトラムを用いた乳腺腫瘍の in vivo生物発光イメージングに

Summary

ルシフェラーゼを発現する乳腺腫瘍細胞をマウスに皮下移植し、縦断的研究で、非侵襲的に腫瘍の成長と発展を監視する光イメージングを用いて可視化されています。

Abstract

4T1マウス乳癌細胞は、15〜20日に触知腫瘍を形成するために、nu / nuマウスに皮下移植することができる。この異種移植腫瘍モデル系では、推定上の抗腫瘍化合物の in vivo評価における前臨床試験のために貴重です。

4T1細胞株は、構成的にホタルルシフェラーゼ遺伝子（luc2）を発現するように設計されています。 4T1 – luc2腫瘍を持つマウスは、腫瘍がIVISスペクトラムのように敏感な光学イメージングシステムを使用して監視することができる視覚的な光信号を発するルシフェリンを注入されている場合。腫瘍からの光子束は、発光細胞の数に比例し、信号が腫瘍の成長と発展を監視するために測定することができます。 IVISは、何ヶ月にわたって実施し、信号の数桁以上の定量的な結果を損なうことなく可能な生物発光信号と縦断的研究の絶対定量を可能にするために較正されています。

腫瘍の大きさは従来の物理的手段によって触知または測定可能になる前に腫瘍の成長は、生物発光で数日間監視することができます。この急速なモニタリングは、腫瘍の開発の初期段階でのイベントへの洞察を提供したり、短い実験手順につながることができます。

低酸素症または薬物治療による腫瘍細胞死と壊死を​​早期に生物発光信号の減少によって示されます。この細胞死は、物理的手段によって測定された腫瘍の大きさの減少を伴うされていない可能性があります。腫瘍壊死の初期のイベントを表示する機能は、治療薬の選択と開発に大きな影響を与えます。

IVISを用いて腫瘍の増殖の定量的イメージングは​​、正確な定量を提供し、結果を生成する実験的なプロセスを加速させます。

Protocol

ルシフェラーゼを発現する癌細胞株の多種多様なマウスモデルにおける前臨床研究に使用することができます。 これらの細胞は容易に選択マーカーを必要とせず、標準のメディアが大きくなると思われる無菌凍結培養物として提供されています。 私たちの実験では、我々はin vivoでの遺伝子発現やtumorgenesisの光学指標となるルシフェラーゼ遺伝子を発現4T1 – luc2マウス乳腺腫瘍細胞株を、使用します。我々は、非侵襲的に原発腫瘍の成長を追跡するためにルシフェラーゼ発現を使用しますが、彼らはまた、転移性病変を検索し、監視するために使用することができます。 ルシフェラーゼ活性は、注射する前に検証する必要があります、そしてこれを実行するためには、90％コンフルエントフラスコをトリプシン処理によって回収してからカウントされます。 50,000個の細胞は、マイクロタイタープレートの1ウェルに分注しており、連続希釈が行われる。ルシフェリン、1m​​l当たり150ugでウェルに添加し、2分間インキュベートする。マイクロプレートは、IVISまたは発現レベルを決定するために発光プレートリーダーで画像化することができます。この細胞株は、毎秒のセルあたり6500光子まで表現し、1秒あたりのセル当たり500光子上記のいずれかの発現レベルは、in vivoで正常に画像化することができます。 今我々は最適な活性の細胞を持っていることを、我々は、皮下注射の手順に進むことができます。 腫瘍の最適な検出を容易にするために、我々は胸腺免疫不全ヌードマウス系統を使用しています。注射の前に、動物は深い麻酔のための効果に麻酔する。 次に我々は100ulのPBSに250,000細胞まで注入されることは脇腹に皮下注射されています。 1mlの注射器で細胞をロードし、26ゲージの針を取り付けます。鉗子は"テント"を作り、基地の細胞を注入することでお肌を持ち上げます。新たに注入された細胞は、すぐにイメージングすることができます。各イメージングセッションでは体重kg当たりルシフェリンの150mgの合計は、腹腔内に2回の注射により投与される。 本研究では、動物が一貫した光子束を確保するためにルシフェリンの投与後10分をイメージされています。我々は、次のステップであなたにこれを紹介します。ルシフェリン反応速度は日によって異なることができる。この特定のモデルでは、ルシフェリンの投与後10分を測定することで15％のばらつきの範囲内の結果を与えた。 私たちの実験のために我々は、in vivoイメージングシステムでIVISスペクトラムを使用します裏面入射電荷結合素子を使用して° C最高感度を達成するために-90に冷却。絶対定量をサポートするために、システムはダウンタイム中に暗い電荷を測定し、初期化時にセルフキャリブレーションを実行します。イメージングを開始するには、IVISシステムを初期化する（ワンクリック）と実験用イメージングパラメータを設定します。 撮像される動物の数のビューのフィールドを選択します。最大5匹の動物に不可欠な麻酔のマニホールドを使用して楽器に維持することができる。ステージでは、° C、動物の体温を維持するために一定の37℃です。 EKGポートは、ストレスの多い処置中に動物の健康を監視するために提供されています。 画像ソフトをリビングでは、露光時間、F – stopとピクセルビニングは、細胞株の発現レベルに基づいて最適化することができます。これらの設定は、定量的な結果に影響を与えることなく、実験中にいつでも変更することができます。 IVISは、白色光と画像の上に重ねている定量的な生物発光または蛍光シグナル、下の動物の写真画像を取得。 生物発光シグナルは、秒あたりの光子で表され、強度マップとして表示されます。画像表示は、定量に影響を与えることなく、画像の最適なコントラストと分解能を提供するように調整されます。 細胞からの発光は、関心のツールの域を使用して、注射の部位で測定することができます。測定データは、分析のために保存またはエクスポートすることができます画像のキャプチャに関連するすべての実験パラメータと一緒にテーブルに表示されます複数の画像を取得し、実験の性質に応じて数秒または数か月をカバーする長期的な研究に比較することができます。我々は、隔週の間隔で撮影して4週間の時間がゼロとモニターで腫瘍から光子束を測定します。 腫瘍からのフォトンフラックスは、生物発光は、腫瘍の大きさと直接相関するので、ルシフェラーゼを発現する生細胞の数に比例します。 5日後の移植で腫瘍はまだ明白ではないが、細胞は生物発光によって定量化することができると腫瘍が積極的に成長しているように見られている。この段階での生物発光シグナルは非常にstrongeですR.露光時間は、F – stopとピクセルビニングは、画像が鮮明になるとカメラが飽和しないように調整することができます。これらの測定は実験の前半​​で、後に収集したものに比較することができるように、IVISは、自動的に集光の変化を補正。 7日間でポスト移植腫瘍は、測定値が既にデータの7日間を生成したのは今回が初めてと生物発光のための触知です。 28日のポストの移植で、腫瘍は壊死性になりつつあると細胞が死ぬことを始める。キャリパー測定により推定された腫瘍のサイズがかなり変更されませんが、腫瘍からの発光は、細胞死を示す減少します。 人道的エンドポイントに到達するまで、キャリパーの測定と生物発光の測定を継続することができます。低酸素症または治療体制に起因する腫瘍壊死は、それらが腫瘍塊を削減していない場合でも減少生物発光によって示されます。