يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر
Summary
في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة يمكن من خلالها تحليل الدماغ النامي في أجنة الفقاريات الزرد يعيش في قرار خلية واحدة بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. ويشمل هذا الأسلوب الذي كنا حقن الجنين الزرد وحيدة الخلية وجبل لاحقا وصورة الدماغ النامي.
Abstract
في هذا الفيديو ، ونحن لشرح طريقة مختبرنا وقد وضعت لتحليل التغييرات وإعادة ترتيب شكل الخلية المطلوبة لثني والطي الدماغ الزرد النامية (Gutzman وآخرون ، 2008). مثل هذا التحليل يعطي فهما جديدا للبيولوجيا الخلية الأساسية اللازمة لتطوير البنية 3D الفقاريات من الدماغ ، ويزيد بشكل كبير من قدرتنا على دراسة التشكل أنبوب العصبي. يتشكل الدماغ الزرد الجنينية ابتداء من الساعة 18 التسميد آخر ساعة (HPF) والبطينين داخل الظهارة العصبية تضخيم. بنسبة 24 HPF ، والخطوات الأولية التشكل الأنبوب العصبي كاملة. باستخدام الطريقة الموصوفة هنا ، يتم حقن الأجنة في مرحلة خلية واحدة مع ترميز الغشاء مرنا استهداف بروتين الفلورية الخضراء (memGFP). HPF بعد الحقن ، والحضانة ، وجنين ، وبين 18 و 24 الآن ، هي التي شنت ، مقلوب ، في agarose والتقط بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. ومن الجدير بالذكر أن الجنين الزرد شفافة مما يجعلها مثالية لنظام التصوير الفلورسنت. في حين ركزت تحليلاتنا على الحدود الدماغ المتوسط ، الدماغ المؤخر والدماغ المؤخر ويمكن تمديد هذه طريقة لتحليل أي منطقة في الزرد إلى عمق 8-10 ميكرون.
Protocol
Discussion
في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة لحقن مرنا في واحد الأجنة الزرد الخلية. هنا ، فإننا نستخدم مرنا ترميز GFP غشاء استهداف لتسمية كل خلية. ثم نظهر كيفية تحميل وصورة الدماغ النامية في قرار خلية واحدة. وقد سمحت لنا هذه التقنية لدراسة نوع جديد من تغيير شكل الخلية ، وا?…
Acknowledgements
جزيل الشكر للدكتور جنيفر Gutzman الذين طوروا الاولى من هذا الأسلوب في مختبر SIVE. أيضا بفضل الخضراء JB في بوسطن دانا فاربر معهد السرطان ، MA الذين قدموا يرجى الترميز البلازميد CAAX – GFP مرنا. أجري التصوير مبائر في مرفق WM مؤسسة كيك التصوير البيولوجي في وايتهيد. معتمد من قبل النظام المنسق NIHMH70926. معتمد من قبل المصري الزمالة بعد الدكتوراه قبل جبهة الخلاص الوطني.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| SeaKem GTG agarose | Reagent | Lonza | 50027 | |
| 3-aminobenzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Capillary tubing | Tool | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm |
| Silicone vacuum grease | Reagent | VWR | W0S717 | |
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
| 1-200 μl Pipette tips | Tool | Tip One, US Scientific | 111-0806 | These are the correct size for 24 hpf embryos. |
| mMessage mMachine transcription kit | Reagent | Ambion | AM1340 | SP6 RNA polymerase |
| Zeiss LSM 510 scanning confocal | Microscope | Zeiss | ||
| Micromanipulator | Tool | Narishige | ||
| Microinjector | Tool | Medical Systems Research Products Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| Micropipette puller | Tool | Sutter Instruments |
References
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: a Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , (1995).
