Zebrafish Cervello iniezione ventricolo
Summary
Dopo la formazione del tubo neurale, il neuroepitelio restringe e le pieghe mentre il tubo si riempie di liquido cerebrospinale embrionale (eCSF) per formare i ventricoli del cervello embrionale. Abbiamo sviluppato questa tecnica ventricolo iniezione per visualizzare meglio lo spazio pieno di liquido in contrasto con la forma neuroepiteliale in un embrione vivo.
Abstract
Corretta formazione ventricolo del cervello durante lo sviluppo embrionale del cervello è necessario per normali funzioni cerebrali. Ventricoli cerebrali sono cavità altamente conservati all'interno del cervello che sono pieni di liquido cerebrospinale. In zebrafish, dopo la formazione del tubo neurale, il neuroepitelio subisce una serie di costrizioni e pieghe mentre si riempie di liquido con conseguente formazione del cervello ventricolo. Al fine di comprendere il processo di formazione del ventricolo, e la forma cambia neuroepiteliale che si verificano allo stesso tempo, abbiamo bisogno di un modo per visualizzare la space ventricolo rispetto al tessuto cerebrale. Tuttavia, la natura di embrioni di zebrafish trasparente rende difficile distinguere il tessuto dallo spazio ventricolo. Pertanto, abbiamo sviluppato una tecnica di ventricolo cerebrale iniezione dove viene riempito lo spazio ventricolo con un colorante fluorescente e ripreso dal campo chiaro e microscopia a fluorescenza. Il campo chiaro e le immagini fluorescenti vengono poi elaborati e sovrapposti in Photoshop. Questa tecnica permette per la visualizzazione dello spazio ventricolo con il colorante fluorescente, rispetto alla forma del neuroepitelio nell'immagine campo chiaro. Ventricolo iniezione cervello in zebrafish può essere impiegato da 18 ore dopo la fecondazione ai primi stadi larvali. Abbiamo usato questa tecnica ampiamente nei nostri studi di formazione del cervello del ventricolo e la morfogenesi e nella caratterizzazione di mutanti morfogenesi del cervello (1-3).
Protocol
Discussion
In questo video ci dimostra come iniettare colorante fluorescente (Texas-Red destrano) nello sviluppo di zebrafish ventricoli del cervello. Questo metodo viene utilizzato per visualizzare lo spazio ventricolo del cervello in contrasto con la neuroepitelio circostante ed è estremamente utile per determinare la forma dello spazio ventricolo così come la forma del tessuto cerebrale circostante. Ci permette di comprendere meglio il processo di formazione del cervello del ventricolo e la morfogenesi del cervello nel tempo …
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Anna Laura Lowery che ha sviluppato questa tecnica in laboratorio. HS è supportato da NIHMH70926. Jennifer Gutzman è stato sostenuto dalla CSBI / Merck borsa di studio post-dottorato.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Capillary Tubes (needles) | Tools | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | |
| Agarose-Coated dishes | Tools | Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning) | Agarose (50027) Dishes (430166) |
Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting |
| Dissecting Microscope | Microscope | Zeiss Stereomicroscope Stemi SV 6 | ||
| Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software | Tools | |||
| 1-200 μ pipette tips | Tools | Tip One, US Scientific | 1111-0806 | These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly. |
| Photoshop | Image Analysis | Adobe | ||
| Embryo Loop | Tools | Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax. | ||
| Microinjector | Tools | Medical Systems Research Products Harvard Apparatus | PL1-100 | |
| Needle Puller | Tools | Sutter Instruments | Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70). | |
| Micromanipulator | Tools | Narishige | ||
| Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW | Reagent | Molecular Probes | D1830 | Other Molecular weights are available if desired. |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester) | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Embryo Media | Reagent | According to Westerfield (5) |
References
- Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
- Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Kimmel, C. B. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , (1995).
