Cerebro del pez cebra ventrículo inyección
Summary
Después de la formación del tubo neural, el neuroepitelio se contrae y se dobla mientras que el tubo se llena de líquido cefalorraquídeo embrionarias (ECSF) para formar los ventrículos del cerebro embrionario. Hemos desarrollado esta técnica de inyección del ventrículo para visualizar mejor el espacio lleno de líquido, en contraste con la forma neuroepitelial en un embrión vivo.
Abstract
Adecuada formación del ventrículo del cerebro durante el desarrollo embrionario del cerebro es necesaria para la función normal del cerebro. Ventrículos del cerebro son las cavidades altamente conservada dentro del cerebro que están llenas de líquido cefalorraquídeo. En el pez cebra, después de la formación del tubo neural, el neuroepitelio se somete a una serie de constricciones y pliegues, mientras que se llena de líquido que resulta en la formación del cerebro del ventrículo. A fin de comprender el proceso de formación del ventrículo izquierdo, y los cambios de forma neuroepitelial que se producen al mismo tiempo, necesitamos una manera de visualizar el espacio ventricular en comparación con el tejido cerebral. Sin embargo, la naturaleza de los embriones de pez cebra transparente hace que sea difícil diferenciar el tejido del espacio ventricular. Por lo tanto, hemos desarrollado un ventrículo cerebral técnica de inyección, donde se llena el espacio ventricular con un tinte fluorescente y la imagen por microscopía de campo claro y fluorescencia. El claro y las imágenes fluorescentes se procesan y se superponen en Photoshop. Esta técnica permite la visualización del espacio ventrículo con el colorante fluorescente, en comparación con la forma de la neuroepithelium en la imagen de campo claro. Inyección cerebral ventrículo en el pez cebra puede ser empleado de 18 horas después de la fecundación a través de las primeras etapas larvales. Hemos utilizado esta técnica ampliamente en nuestros estudios de la formación del cerebro del ventrículo y la morfogénesis, así como en la caracterización de mutantes del cerebro morfogénesis (1-3).
Protocol
Discussion
En este video se muestra cómo inyectar un colorante fluorescente (Texas-Red dextrano) en el desarrollo de los ventrículos del cerebro del pez cebra. Este método se utiliza para visualizar el espacio ventrículo del cerebro, en contraste con el neuroepitelio rodea y es extremadamente útil para determinar la forma del espacio ventricular, así como la forma del tejido cerebral circundante. Nos permite entender mejor el proceso de formación del cerebro del ventrículo y la morfogénesis del cerebro a través del tiemp…
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Laura Anne Lowery quien desarrolló esta técnica en el laboratorio. SA, con el apoyo de NIHMH70926. Jennifer Gutzman fue apoyado por la beca CSBI / Merck postdoctoral.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Capillary Tubes (needles) | Tools | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | |
| Agarose-Coated dishes | Tools | Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning) | Agarose (50027) Dishes (430166) |
Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting |
| Dissecting Microscope | Microscope | Zeiss Stereomicroscope Stemi SV 6 | ||
| Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software | Tools | |||
| 1-200 μ pipette tips | Tools | Tip One, US Scientific | 1111-0806 | These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly. |
| Photoshop | Image Analysis | Adobe | ||
| Embryo Loop | Tools | Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax. | ||
| Microinjector | Tools | Medical Systems Research Products Harvard Apparatus | PL1-100 | |
| Needle Puller | Tools | Sutter Instruments | Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70). | |
| Micromanipulator | Tools | Narishige | ||
| Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW | Reagent | Molecular Probes | D1830 | Other Molecular weights are available if desired. |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester) | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Embryo Media | Reagent | According to Westerfield (5) |
References
- Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
- Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Kimmel, C. B. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , (1995).
