Zebra balığı Beyin Ventrikül Enjeksiyon
Summary
Nöral tüp oluşumu sonra neuroepithelium daraltır ve tüp embriyonik beyin ventriküller oluşturmak için embriyonik beyin omurilik sıvısı (eCSF) ile doldurur katlanabilir. Biz daha iyi, canlı embriyo nöroepitelyal şekli aksine sıvı dolu boşluk görselleştirmek için bu ventrikül enjeksiyon tekniği geliştirdi.
Abstract
Uygun embriyonik beyin gelişimi sırasında beyin ventrikül oluşumu normal beyin fonksiyonu için gereklidir. Beyin ventriküller, beyin omurilik sıvısı ile dolu, beynin içinde son derece korunmuş boşluklar vardır. Zebra balığı olarak, nöral tüp oluşumu sonrası, beyin ventrikül oluşumu ile sonuçlanan bir sıvı ile doldurur neuroepithelium daralması ve kıvrımlarının bir dizi uğrar. Ventrikül oluşum süreci, aynı zamanda meydana gelen nöroepitelyal şekil değişiklikleri anlamak için, beyin dokusu ile karşılaştırıldığında ventrikül alanı görselleştirmek için bir yol gerekiyordu. Ancak, şeffaf zebrafish embriyoların doğası zor ventrikül uzaydan gelen doku ayırt etmek için yapar. Bu nedenle, ventrikül alan floresan boya ile doldurulmuş ve aydınlık ve floresan mikroskobu ile görüntülü bir beyin ventrikül enjeksiyon tekniği geliştirdi. Aydınlık ve floresan görüntüler daha sonra işlenmiş ve Photoshop bindirilmiş. Bu teknik, aydınlık görüntü neuroepithelium şekline göre, floresan boya ile ventrikül alanı görünüm için sağlar. Zebrafish Beyin ventrikül enjeksiyon erken larva aşamalardan 18 saat sonra döllenme ile istihdam edilebilirler. Biz yanı sıra beyin morfolojilerinden mutantlar (1-3) karakterize beyin ventrikül oluşumu ve morfolojilerinden çalışmalarımız yoğun bu tekniği kullanmıştır.
Protocol
Discussion
Bu video floresan boya (Texas-Kırmızı Dextran) Zebra balığı beyin ventriküller gelişmekte içine enjekte etmek için nasıl gösterilmektedir. Bu yöntem beynin ventrikül alanı çevreleyen neuroepithelium aksine görselleştirmek için kullanılan ve ventrikül alanı şekline yanı sıra çevredeki beyin dokusu şeklini belirlemek için son derece yararlı. Bu zaman içinde canlı embriyo beyin ventrikül oluşumu ve beyin morfolojilerinden süreci daha iyi anlamak için bize izin verir. Bu teknik, beyin vent…
Acknowledgements
Yazarlar, laboratuvar bu tekniği geliştirdi Laura Anne Lowery teşekkür etmek istiyorum. HS NIHMH70926 tarafından desteklenmektedir. Jennifer Gutzman CSBi / Merck, doktora sonrası burs tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Capillary Tubes (needles) | Tools | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | |
| Agarose-Coated dishes | Tools | Agarose (Seakem GTG; Lonza) Dishes (Corning) | Agarose (50027) Dishes (430166) |
Make agarose approximately 2-3 mm deep in the dish depending on the stage of embryo you are injecting |
| Dissecting Microscope | Microscope | Zeiss Stereomicroscope Stemi SV 6 | ||
| Microscope Camera with Fluorescence capabilities and with image capture software | Tools | |||
| 1-200 μ pipette tips | Tools | Tip One, US Scientific | 1111-0806 | These are the perfect size to poke the holes in the agarose and have the embryos fit perfectly. |
| Photoshop | Image Analysis | Adobe | ||
| Embryo Loop | Tools | Make these yourself with a glass pipette and hair or fishing line and seal with beeswax. | ||
| Microinjector | Tools | Medical Systems Research Products Harvard Apparatus | PL1-100 | |
| Needle Puller | Tools | Sutter Instruments | Settings (Heat 785, Pull 70, Velocity 40, Time 70). | |
| Micromanipulator | Tools | Narishige | ||
| Fluorescent dye Texas-Red Dextran 70,000MW | Reagent | Molecular Probes | D1830 | Other Molecular weights are available if desired. |
| Tricaine (3-aminobenzoic acid ethyl ester) | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Embryo Media | Reagent | According to Westerfield (5) |
References
- Gutzman, J. H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech. Dev. 125, 974-983 (2008).
- Lowery, L. A. Characterization and Classification of Zebrafish Brain Morphology Mutants. Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Kimmel, C. B. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish. , (1995).
