Pez cebra todo el montaje de alta resolución doble fluorescente In Situ La hibridación

Summary

Todo el montaje hibridación in situ es una de las técnicas más utilizadas en la biología del desarrollo. Aquí se presenta una alta resolución de doble fluorescente en el protocolo de hibridación in situ para analizar el patrón de expresión precisa de un solo gen y para determinar la superposición de los dominios de expresión de dos genes. Se incluye un yoduro de propidio nuclear tinción de contraste para destacar la organización del tejido.

Abstract

Todo el montaje<em> In situ</emHibridación> es una de las técnicas más utilizadas en la biología del desarrollo. Aquí se presenta una alta resolución de doble fluorescente<em> In situ</em> Hibridación protocolo para el análisis del patrón de expresión precisa de un solo gen y para determinar la superposición de los dominios de expresión de dos genes. El protocolo es una versión modificada de la norma<em> In situ</em> Hibridación con fosfatasa alcalina y los sustratos tales como NBT / BCIP y Fast Red^1,2. Este protocolo utiliza sondas estándar digoxigenina y fluoresceína junto a la amplificación de la señal tyramide (TSA)³. Los kits disponibles en el mercado TSA permite un diseño flexible experimental como la emisión de fluorescencia de color verde a rojo lejano se puede utilizar en combinación con diferentes manchas nucleares, como el yoduro de propidio, o inmunohistoquímica de fluorescencia de las proteínas. TSA produce un sustrato reactivo fluorescente que rápidamente se une covalentemente a restos, los residuos de tirosina general, en las inmediaciones de la riboprobe antisentido marcado. Los patrones de tinción resultantes son de alta resolución en que la localización subcelular de los ARNm se puede observar con microscopía confocal de barrido láser^3,4. Se puede observar transcripciones naciente en los loci cromosómicos, distinguir la tinción nuclear y citoplasmática y visualizar los patrones de otros, tales como la localización cortical del ARNm. Los estudios realizados en<em> Drosophila</em> Indican que aproximadamente el 70% de los ARNm muestran patrones específicos de la localización subcelular de que con frecuencia se correlacionan con la función de la proteína codificada⁵. Cuando se combina con la reconstrucción por ordenador de conjuntos de datos 3D confocal, el protocolo permite el análisis detallado de la distribución del ARNm con resolución subcelular en embriones de los vertebrados conjunto.

Protocol

1. FIJACIÓN Fix embriones noche a 4 ° C con 4% paraformaldehído (PFA) en PBS. Quitar arreglar y lavar 2 x PBS, 5 minutos cada uno, a temperatura ambiente (RT). Embriones manualmente dechorionate en PBS en una placa de vidrio depresión usando pinzas de relojero. Después de dechorionation, los embriones se transfieren por medio de un pulido al fuego pipeta Pasteur de vidrio, ya que puede adherirse a las pipetas de polipropileno. La transferencia de embriones a través de una s…

Discussion

El protocolo presentado aquí funciona bien con las sondas que dar una señal fuerte limpia después de la tinción de 30-45 minutos en una fosfatasa alcalina típica mediada por la reacción. Antes de realizar la fluorescencia en el protocolo de hibridación in situ, siempre prueba de nuestras sondas utilizando el estándar de protocolo no fluorescente (siempre en el material complementario junto con el protocolo de síntesis de la sonda). Hemos tenido menos éxito con los fluorescentes en el protocolo de hibridación …

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade		Electron Microscopy Services	15710	Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C
Proteinase K, recombinant PCR grade		Roche	03115879001	Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C
Blocking Reagent		Roche	11096176001	Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws.
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments		Roche	11426346910	Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C.
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments		Roche	11207739910	As above.
TSA Plus Fluorescein system		Perkin Elmer	NEL741001KT	Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C.
TSA Plus Cyanine5 system		Perkin Elmer	NEL745001KT	As above
TSA Plus Cyanine3 system		Perkin Elmer	NEL744001KT	As above
TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG)		Molecular Probes /Invitrogen	T20926	Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C.
RNase, DNase free		Roche	11119915001	Supplied as 500μg/ml solution
Propidium Iodide		Molecular Probes /Invitrogen	P-3566	Supplied as 1mg/ml solution in water.