Zebrafish 전체 마운트 고해상도 더블 형광등 현장에서 하이브 리다이 제이션

Summary

현장 하이브리드화의 전체 마운트 발달 생물학에서 가장 널리 사용되는 기법 중 하나입니다. 여기, 우리는 단일 유전자의 정확한 표현 패턴을 분석하는 두 유전자의 표현 도메인의 중복을 결정하는 현장 하이브리드화 프로토콜을 두 번 형광 높은 해상도를 제시한다. 우리는 조직 조직을 강조하기 위해 propidium 요오드화물 핵 카운터 얼룩이 포함됩니다.

Abstract

전체 마운트<em> 현장에서</em> 하이브 리다이 제이션은 발달 생물학에서 가장 널리 사용되는 기법 중 하나입니다. 여기서 우리는 고해상도 이중 형광을 제시<em> 현장에서</em단일 유전자의 정확한 표현 패턴을 분석하는 두 유전자의 표현 도메인의 중복을 결정> 하이브리드화 프로토콜. 프로토콜은 표준의 수정된 버전입니다<em> 현장에서</em알칼리성 인산 가수 분해 효소와 같은 NBT / BCIP 빠른 레드와 같은 기판을 사용하여> 하이브 리다이 제이션^1,2. 이 프로토콜은 tyramide 신호 증폭 (TSA)과 함께 표준 digoxygenin 및 플루오레신 라벨 프로브를 활용³. 상용 TSA 키트는 녹색에서 멀리 빨간색 형광 방출로 유연하게 실험적인 디자인이 같은 propidium 요오드화물 또는 단백질에 대한 형광 immunohistochemistry 등 다양한 핵 얼룩,와 함께 사용할 수 있습니다. TSA 빠르게 covalently 표시 안티 센스 riboprobe의 인근에 moieties, 일반적으로 티로신 잔류물에 바인딩 반응 형광 기판을 생산하고 있습니다. 그 결과 얼룩 패턴은 mRNA의 subcellular 지방화에 고해상도 아르는 공촛점 현미경을 스캐닝 레이저를 사용하여 관찰할 수^3,4. 하나는 염색체 loci에서 초기 기록을 관찰 핵 및 세포질 얼룩을 구분하여 mRNA의 대뇌 피질의 현지화 등 다른 패턴을 시각화 수 있습니다. 의 연구<em> Drosophila</em> mRNAs의 약 70 %가 자주 인코딩 단백질의 기능과 상관 관계 subcellular 지방화의 특정 패턴을 전시 것을 나타냅니다⁵. 3D 공촛점 데이터 세트의 컴퓨터 지원 재건과 결합하면, 우리의 프로토콜은 전체 척추의 배아에서 하위 셀룰러 해상도 mRNA 분포의 상세한 분석을 수 있습니다.

Protocol

1. 정치 4 박 배아 ° C PBS에 4 % paraformaldehyde (PFA)와. 문제를 해결 삭제 수정하고 실온 (RT)에서 2 X PBS 5 분 각각 씻으십시오. 시계 제조인의 집게를 사용하여 유리 우울증 플레이트의 PBS에서 수동으로 dechorionate 배아. 그들은 폴리 프로필렌의 pipettes에 충실 수 있으므로 dechorionation 후, 배아는 불을 광택 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 전송됩니다. 오분 각 25 %의 일련의 50 …

Discussion

The protocol presented here works well with probes that give a clean strong signal after staining for 30-45 minutes in a typical alkaline phosphatase-mediated reaction. Prior to performing the fluorescent in situ hybridization protocol, we always test our probes using the standard non-fluorescent protocol (provided in supplemental material along with the probe synthesis protocol). We have had less success with the fluorescent in situ hybridization protocol when using weaker probes, but it may be possible in some cases….

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Paraformaldehyde 16% solution, EM Grade		Electron Microscopy Services	15710	Dilute to 4% in 1.33x PBS (final 1x). Store in 2ml aliquots at –20°C
Proteinase K, recombinant PCR grade		Roche	03115879001	Make a 20mg/ml stock solution in water. Store in 1ml aliquots at –20°C
Blocking Reagent		Roche	11096176001	Make a 10% stock solution in 1x maleic acid buffer. Store in 50ml aliquots at –20°C. Stable over multiple freeze/thaws.
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments		Roche	11426346910	Aliquot and store at -20°C. Keep one working aliquot at 4°C.
Anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments		Roche	11207739910	As above.
TSA Plus Fluorescein system		Perkin Elmer	NEL741001KT	Prepare each vial of TSA reagent only when needed. Dissolve in 60μl DMSO. Store at 4°C.
TSA Plus Cyanine5 system		Perkin Elmer	NEL745001KT	As above
TSA Plus Cyanine3 system		Perkin Elmer	NEL744001KT	As above
TSA Kit #16 AlexaFluor647 tyramide (plus HRP-goat-anti-rabbit IgG)		Molecular Probes /Invitrogen	T20926	Dissolve tyramide reagent in 150μl DMSO, aliquot and store at –20°C.
RNase, DNase free		Roche	11119915001	Supplied as 500μg/ml solution
Propidium Iodide		Molecular Probes /Invitrogen	P-3566	Supplied as 1mg/ml solution in water.