Detektion von Protein Ubiquitination
Summary
Ubiquitinierung ist ein wichtiger posttranslationale Modifikation durch eine Gruppe von drei Enzymen durchgeführt. Mutationen von Genen in dieser Modifikation beteiligt sind mit vielen verschiedenen menschlichen Krankheiten assoziiert. Hier beschreiben wir Protokolle, um Protein-Ubiquitinierung in kultivierten Zellen erkennen<em> In vivo</em> Und Reagenzgläser<em> In-vitro-</em>.
Abstract
Ubiquitinierung, die kovalente Bindung des Polypeptids Ubiquitin an Proteine Ziel, ist ein wichtiger posttranslationale Modifikation durch eine Gruppe von drei Enzymen durchgeführt. Dazu gehören Ubiquitin-aktivierende Enzym E1, Ubiquitin-Konjugation Enzym E2 und E3-Ubiquitin-Ligase. Im Gegensatz zu E1 und E2, E3 Ubiquitin-Ligasen Display Substratspezifität. Auf der anderen Seite haben zahlreiche deubiquitylating Enzyme Rollen in der Verarbeitung polyubiquitinierte Proteine. Ubiquitination kann zu einer Veränderung der Stabilität des Proteins, zelluläre Lokalisation und biologischen Aktivität führen. Mutationen von Genen in die Ubiquitinierung / deubiquitination Weg oder verändert Ubiquitin-System-Funktion beteiligt sind, mit vielen verschiedenen Krankheiten wie verschiedene Arten von Krebs, Neurodegeneration und metabolischen Erkrankungen. Der Nachweis von veränderten oder normale Ubiquitinierung von Target-Proteinen kann zu einem besseren Verständnis der Pathogenese dieser Erkrankungen. Hier beschreiben wir Protokolle, um Protein-Ubiquitinierung in kultivierten Zellen erkennen<em> In vivo</em> Und Reagenzgläser<em> In-vitro-</em>. Diese Protokolle sind auch nützlich, um anderen Ubiquitin-ähnlichen kleinen Molekülen Modifikation wie sumolyation und neddylation erkennen.
Protocol
Discussion
In dieser Präsentation haben wir zum ersten Mal beschrieben Schritte, die Erkennung Ubiquitin Änderung auf ein Protein von Interesse in Säugetierzellen zu erlauben. Um Ubiquitinierung spezifisch nachzuweisen auf das Protein von Interesse, nicht auf nicht-kovalent interagierende Proteine, verwendeten wir eine stringente Bedingung für Zell-Lyse, Immunpräzipitation und Waschen 1,3. Ubiquitination, durch Immunpräzipitation von Zielprotein in solch rauen Bedingungen durch Anti-Ubiquitin-Immunoblot gefolgt er…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
California Institute for Regenerative Medicine gewährt RS1-00331-1 und RL1-00682-1 (bis Z. Zhang);; die amerikanische Parkinson Diese Arbeit wurde vom NIH gewährt RO1 DC006497, RO1 NS057289 und PO1 ES016738 (bis Z. Zhang) unterstützt Disease Association (bis Z. Zhang und YS Choo) und die Michael J. Fox Foundation for Parkinson Research (Z. Zhang).
References
- Xiong, H. PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation. J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).
- Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibits its transcriptional activity. Cell. 118, 83-97 (2004).
- Didier, C. RNF5, a RING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillin ubiquitination and altered localization. Mol Cell Biol. 23, 5331-5345 (2003).
- Laney, J. D., Hochsetrasser, M. Unit 14.5 Analysis of Protein Ubiquitination. Current Protocols in Protein Science. , 14.5.1-14.5.11 (2002).
