Imaging exocytose in het netvlies bipolaire cellen met TIRF Microscopie
Summary
In deze video laten we zien hoe te labelen en te visualiseren enkele synaptische blaasjes exocytose en handel in goudvissen het netvlies bipolaire cellen met behulp van totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie.
Abstract
Totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie is een techniek die de studie van de gebeurtenissen op het celmembraan kunnen door selectieve beeldvorming van fluorescerende moleculen die het dichtst bij een hoge brekingsindex stof zoals glas<sup> 1</sup>. In dit artikel, passen we deze techniek om de afbeelding exocytose van synaptische blaasjes in retinale bipolaire cellen geïsoleerd uit de goudvis netvlies. Deze neuronen zijn zeer geschikt voor dit soort van onderzoek vanwege hun grote axon terminals. Door het gelijktijdig patch het vastklemmen van de bipolaire cellen, is het mogelijk om de relatie tussen pre-synaptische spanning en synaptische los<sup> 2,3</sup>. Synaptische blaasjes in de bipolaire cel terminals worden geladen met een fluorescerende kleurstof (FM 1-43 ®) door co-puffend de kleurstof en een ringer oplossing met een hoge K<sup> +</sup> De concentratie op de synaptische terminals. Dit depolariseert de cellen en stimuleert endocytose en de daaruit voortvloeiende kleurstof opname in het glutamaat blaasjes. Na het wassen de overtollige kleurstof weg voor ongeveer 30 minuten, cellen zijn er klaar voor zijn patch geklemd en afgebeeld gelijktijdig met een 488 nm laser. De patch pipet oplossing bevat een rhodamine-based peptide dat selectief bindt aan de synaptische lint eiwit ribeye<sup> 4</sup>, Waardoor de etikettering linten in het bijzonder wanneer terminals zijn afgebeeld met een 561 nm laser. Hierdoor kan de precieze lokalisatie van de actieve zones en de scheiding van synaptische van extra-synaptische evenementen.
Protocol
Discussion
De voordelen van objectieve-type TIRF microscopie zijn dat 1) het uitstekende optische sectie biedt door het beperken van excitatie licht naar een smal gebied in het brandvlak van de doelstelling, waardoor het minimaliseren van out-of-focus licht, 2) omdat het licht daalt exponentieel met de afstand kan beweging in een verticale richting worden gevolgd als een verandering in de fluorescentie-intensiteit, 3) efficiënte licht collectie door de hoge numerieke apertuur doel 1,5.
Het belangrijkste nadeel van de techniek is da…
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH Grant EY 14.990.
References
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones. Nature. 406, 849-854 (2000).
- Zenisek, D. Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).
- Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. Visualizing synaptic ribbons in the living cell. J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).
- Axelrod, D. Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives. J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).
- Rouze, N. C., Schwartz, E. A. Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse. J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).
