Primaire Cultuur van volwassen ratten Heart myocyten
Summary
In dit artikel beschrijven we een typische manier om te isoleren en cultuur volwassen ratten hart myocyten. Collagenase en protease worden gebruikt voor het verteren en te isoleren single myocyten. Myocyten gekweekte volgen van dit protocol voldoen aan de meeste eisen experiment.
Abstract
Gekweekte primaire volwassen knaagdieren hart-cellen zijn een belangrijk model voor cardiovasculair onderzoek. Toch kunnen stellen en daarvoor solide, levensvatbare gekweekte volwassen myocyten wordt een technisch uitdagende, snelheidsbeperkende stap voor vele onderzoekers. Hier hebben we beschreven een protocol om een hoge opbrengst van volwassen ratten hart myocyten dat levensvatbaar te blijven in de cultuur gedurende enkele dagen te verkrijgen. Het hart is geïsoleerd en geperfuseerd met collagenase en protease onder lage Ca<sup> 2 +</sup> Voorwaarden om een myocyten herstellen. Ca<sup> 2 +</sup>-Tolerante cellen zijn verkregen door de stapsgewijze verhoging van extracellulaire Ca<sup> 2 +</sup> Concentratie in drie opeenvolgende wasstappen. Cellen worden gefilterd, geresuspendeerd in kweekmedium, en uitgeplaat op laminine gecoat enten. Verkregen gekweekt myocyten gebruik van dit protocol levensvatbaar zijn voor maximaal vier dagen en zijn geschikt voor de meeste experimenten, inclusief de elektrofysiologie, biochemie, beeldvorming en moleculaire biologie.
Protocol
Discussion
Een kritische stap is de snelheid waarmee de geïsoleerde hart wordt opgehangen op het perfusie-systeem. De lengte van de enzymatische vertering periode kan een beetje verschillend voor elke rat. De aanpassing is afhankelijk van hoe zacht het hart wordt na de reguliere periode van de spijsvertering. De langzaam herstel van de Ca 2 + na-enzym digestie is essentieel voor het verkrijgen van Ca 2 +-tolerante gezonde cellen.
Voor de cavia, het protocol is hetzelfde, behalve …
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma | S6191 | ||
| KCl | Sigma | P9541 | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | ||
| K2HPO4 | Sigma | P9666 | ||
| MgSO4 | Fluka | 63068 | ||
| Glucose | Sigma | G7021 | ||
| CaCl2 | Sigma | C7902 | ||
| Heparin Sodium Salt | Sigma | H4784 | ||
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical | LS004176 | ||
| Protease XIV | Sigma | P5147 | ||
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | ||
| Carnitine | Sigma | C9500 | ||
| Taurine | Sigma | T0625 | ||
| Glutamic Acid | Sigma | G1501 | ||
| BSA | Sigma | A3294 | ||
| Creatine | Sigma | C3630 | ||
| Antibiotic | Cellgro | 30-009-CI | ||
| Media 199 | GIBCO | 11150 | ||
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | ||
| Laminin | BD Bioscience | 354232 | ||
| water bath | Fisher Scientific | 15-462-5 | ||
| variable flow chemical pump | Fisher Scientific | 15-077-67 | ||
| 6-well culture plate | Corning | 3516 |
References
- Miriyala, J., Nguyen, T., Yue, D. T., Colecraft, H. M. Role of CaVbeta subunits, and lack of functional reserve, in protein kinase A modulation of cardiac CaV1.2 channels. Circ Res. 102 (7), e54-e64 (2008).
- SX, T. a. k. a. h. a. s. h. i., Mittman, S., Colecraft, H. M. Distinctive modulatory effects of five human auxiliary beta2 subunit splice variants on L-type calcium channel gating. Biophys. , 84-845 (2003).
