大型插入环境基因组文库生产
Summary
是描述一个与环境基因组DNA经季节性缺氧峡湾的垂直深度连续分离的fosmid库建设。由此产生的克隆库回升到384孔板和存档，为下游的测序和一个自动化殖民地采摘系统的应用功能筛选。
Abstract
微生物在自然界中的绝大多数，目前仍无法进入传统的种植方法。在过去的十年中，独立的文化环境基因组（<em>即</em>宏基因组）的方法已经出现，使研究人员的桥梁，通过直接从环境中捕获的土著微生物群落的遗传内容种植的差距。为此，尽管巧妙的实验室克隆技术，基因组DNA库使用标准。在这里，我们描述了与经季节性缺氧峡湾垂直深度连续的DNA插入一个大环境fosmid基因库的建设。该协议是直接挂钩的一系列连接的协议，包括沿海海水取样[1]，微生物生物量大量过滤[2]和DNA提取和纯化协议[3]。首先，高品质的基因组DNA与创造的5 – 磷酸两端钝月底修复。最终修复DNA的脉冲场凝胶电泳（PFGE）的大小选择和执行收回30至60万个碱基对的长度（KB）的DNA片段凝胶萃取。大小选择的DNA纯化远离PFGE凝胶基质和结扎磷酸酶治疗钝fosmid CopyControl载体pCC1（震中<a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385"> http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>）。 pCC1和插入DNA的线性concatemers随后headfull的lambda terminase包装成噬菌体颗粒，随后感染的抗噬菌体<em> E。大肠杆菌</em>细胞。抗生素的选择下，成功转染克隆LB琼脂平板上恢复和384孔板使用一个自动化的殖民地采摘机器人（Qpix2，GENETIX）的格式存档。目前的协议，吸引了来自各种来源，包括CopyControl Fosmid图书馆震中生产套件多个研究小组已经发表的作品[4-7]。每一步都是与心目中的最佳做法。只要有可能，我们强调在执行细微之处，以提高整体质量和图书馆的生产效率。 fosmid库生产和自动化殖民地采摘的整个过程至少需要7-10天，因为有很多孵化步骤包括。然而，有几个停车点可能是在协议中提到的。
Protocol
Discussion
一个过程描述了如何最有效地产生大插入fosmid从沿海水样的基因组DNA库。上游基因组DNA的提取是在一个单独的协议[3]。
由于fosmid库生产是一个多步骤的过程中，计划整个过程，包括提出的所有四个步骤的时间至少需要两到三个星期。基因组DNA的提取是最关键的一步，所有下游步骤依靠提取的基因组DNA的质量和数量;，所以考虑这一步花费足够的时间和工作细心。您提取的DNA的?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢支持沿海和公海水域低氧气地区正在进行的研究创新，不列颠哥伦比亚省知识发展基金和国家科学和工程研究理事会（NSERC），加拿大的加拿大基金会。 MT与SL支持由图拉基金会资助中心微生物的多样性和进化（CMDE）的奖学金。吨，还收到了德意志研究联合会（DFG）的奖学金支持。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Step II | ||||
| CopyControl™ Fosmid Library Production Kit | EPICENTRE | CCFOS110 | sufficient to generate 9-10 fosmid libraries | |
| SeaPlaque Agarose | Cambrex | 50100 | ||
| stirring hot plate | Corning | PC-420D | ||
| 1.0X TAE running buffer | ||||
| CHEF Mapper XA pulsed field electrophoresis system including cooling module and variable speed pump | Bio-Rad | |||
| λ DNA-HindIII Digest | NEB | N3012S | ||
| MidRange I PFG Marker | NEB | N3551S | ||
| 10,000X SYBR Gold | Invitrogen | S11494 | ||
| microwavable plastic wrap | Saran premium wrap | |||
| Safe Imager transilluminator | Invitrogen | S37102 | ||
| GELase Agarose Gel-Digesting Preparation | EPICENTRE | G09100 | ||
| scalpel | Fisher Scientific | 08-927-5D | ||
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | Millipore | UFC801024 | ||
| Microcon YM-30 Centrifugal Filter Unit | Millipore | 42410 | ||
| nuclease free water | Ambion | AM9932 | ||
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit *2000 assays*# | Invitrogen | P7589 | ||
| digital dry block heater | VWR | 12621-088 | ||
| water bath | VWR | 14231-854 | ||
| centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E | ||
| centrifuge rotor | Beckman Coulter | JA 5.3 | ||
| table top centrifuge | Eppendorf | 5415D | ||
| microcentrifuge tubes, 1.7 mL, clear | Axygen | MCT-175-C | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| Step III | ||||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M2643 | ||
| phage dilution buffer | 10 mM Tris-HCl [pH 8.3], 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 | |||
| cryogenic vials | Fisher-Corning | 430488 | ||
| Step IV | ||||
| 96 well plate with lid | Fisher-Corning | CS003370(3370) | ||
| 384 well plate with lid | Fisher-Corning | 07201157(3680) | ||
| Petri dishes 100 O.D. x 15mm H | Fisher | 08-757-12 | ||
| Petri dishes 150 Dia. x 15mmH | Fisher | 08-757-14 | ||
| BD Falcon BioDish XL 245 X 245 mm | VWR | CABD351040 | ||
| glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | ||
| chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | ||
| LB broth | Fisher Scientific | BP 1426-2 | ||
| Difco Agar | BD | 214530 | ||
| glass beads | Fisher Scientific | 10-310-1 | ||
| QFill3 | Genetix | X3050 | ||
| Bleach | Javex | |||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | ||
| 15 mL centrifuge tubes | Fisher-Corning | 430052 | ||
| QPix colony picker | Genetix | QPix2 | ||
| picking head (E. coli) | Genetix | X4006 |
References
- Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
- Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J. DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation. J Vis Exp. 31, 10-3791 (2009).
- Stein, J. L., Marsh, T. L., Wu, K. Y., Shizuya, H., DeLong, E. F. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon. J. Bacteriol. 178, 591-599 (1996).
- Béjà, O., Suzuki, O., Koonin, M. T., Aravind, E. V., Hadd, L., Nguyen, L. P. A., Villacorta, R., Amjadi, M., Garrigues, C., Jovanovich, S. B., Feldman, R. A., DeLong, E. F. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage. Environ. Microbiol. 2, 516-529 (2000).
- DeLong, E. F., Preston, C. M., Mincer, T., Rich, V., Hallam, S. J., Frigaard, N. -. U., Martinez, A., Sullivan, M. B., Edwards, R., Brito, B. R., Chisholm, S. W., Karl, D. M. Community genomics among stratified microbial assemblages in the Ocean’s interior. Science. 311, 496-503 (2006).
- Hallam, S. J., Putnam, N., Preston, C. M., Detter, J. C., Rokhsar, D., Richardson, P. M., DeLong, E. F. Reverse methanogenesis: testing the hypothesis with environmental genomics. Science. 305, 1457-1462 (2004).
