Suivi dynamique de prise de greffe musculaire chez les petits animaux par des In Vivo Fluorescent Imaging

Summary

Nous décrivons une In vivo Imagerie de fluorescence protocole à suivre la régénération du muscle par la GFP-étiquetée myoblastes après la transplantation dans les muscles squelettiques des souris à la fois sain et dystrophiques. Ce protocole peut être adapté à l'étude la régénération musculaire par transplantation d'autres types de cellules et dans d'autres conditions musculaires ainsi.

Abstract

Les dystrophies musculaires sont un groupe de maladies musculaires dégénératives caractérisées par une perte progressive des cellules musculaires contractiles. Actuellement, il n'existe aucun traitement curatif. Les avancées récentes en biologie des cellules souches ont généré de nouveaux espoirs pour le développement de thérapies cellulaires efficaces basées pour traiter ces maladies. La transplantation de différents types de cellules souches étiquetées avec des protéines fluorescentes dans les muscles de modèles animaux dystrophiques a été largement utilisé dans le domaine. Une technique non invasive avec la capacité de suivre le destin des cellules transplantées longitudinalement peuvent encore notre capacité à évaluer la prise de greffe de muscle par les cellules transplantées plus précise et efficace.

Dans la présente étude, nous démontrons que la fluorescence in vivo d'imagerie est une méthode sensible et fiable pour le suivi de la GFP transplantés (Green Fluorescent Protein) cellules marquées dans les muscles squelettiques de souris. En dépit de la préoccupation de fond dû à l'utilisation d'une lumière extérieure nécessaire à l'excitation de la protéine fluorescente, nous avons constaté que ce soit en utilisant la souris nude ou en éliminant les cheveux avec des réactifs d'épilation beaucoup plus de ce problème est éliminé. En utilisant une caméra CCD, le signal fluorescent peut être détecté dans le jambier antérieur (TA) du muscle après l'injection de 5 x 10 ⁵ cellules soit de souris transgéniques GFP ou EGFP transduites la culture des myoblastes. Pour des muscles plus superficielles telles que l'extenseur commun des orteils (EDL), l'injection de moins de cellules produit un signal détectable. L'intensité du signal peut être mesurée et quantifiée comme le nombre de photons émis par seconde dans une région d'intérêt (ROI). Depuis les images acquises montrent des limites claires délimitant la zone implantée, la taille de la ROI peut être mesuré aussi bien. Si les jambes sont placés systématiquement à chaque fois, les changements dans le nombre total de photons par seconde et par les muscles et la taille de la ROI de refléter les changements dans le nombre de cellules greffées et la taille de la zone greffée. Par conséquent, les modifications dans le même muscle au cours du temps sont quantifiables. In vivo technique d'imagerie fluorescente a été utilisée principalement pour suivre la croissance des cellules tumorigène, notre étude montre qu'il est un outil puissant qui nous permet de suivre le destin des cellules souches transplantées.

Protocol

Préparation de cellules

1. L'isolement cellulaire par satellite
   1. Sous anesthésie, des muscles des membres des souris transgéniques GFP (C57BL / Ka-βactin-EGFP) sont supprimés. Après avoir coupé en petits morceaux, les cellules satellites sont enzymatiquement dissocié en incubant le tissu hachée avec une solution dispase collagénase 2% pendant 1 heure à 37 ° C.
   2. Neutraliser la digestion enzymatique avec les milieux de croissance contenant Ham F-10 et de 20% de FBS, dissocier les muscles par trituration répétée avec une pipette Pasteur. Les cellules sont filtrés à travers une passoire cellule (ø70-100 microns) et ensuite étalées sur un plat non revêtus pendant 1 heure à 37 ° C.
   3. Retirer délicatement le surnageant et la plaque de les sur un plat recouvert de collagène. Répétez cette étape 1 heure plus tard, pour purifier les myoblastes. (Pré-plaque)
   4. Changer les médias et les plaques des cellules dans le temps. Les myoblastes final purifié sont cultivées dans un milieu contenant Ham F-10, 20% de FBS, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine (milieu de croissance) à 37 ° C avec 5% de CO2, 95% d'air.
   
   
2. Culture et élargir les myoblastes primaires en milieu de croissance avec l'ajout de FGF basique de 10 ng / ml.
3. Pour toutes les expériences in vivo, nous injectons 5x10 ⁵ cellules par muscle TA.
4. Lorsque la récolte des myoblastes, nous détacher les cellules en utilisant 0,25% de trypsine / EDTA et les laver avec du PBS deux fois. Le nombre de cellules sont comptées avec un hémocytomètre et les cellules sont remises en suspension dans HBSS à une concentration de 5x10 ⁴ cellules / ul. Les cellules concentrées dans HBSS sont placés sur la glace et injecté 1 heure après la collecte.

L'imagerie in vivo

1. Homme souris mdx à l'âge de 4-6 semaines sont achetés auprès de Jackson laboratoire et maintenue à une facilité de logement des animaux.
2. Après environ une semaine d'hébergement à l'environnement, les souris sont prêts à être implantés avec des cellules cultivées.
3. Avant la transplantation de cellules, la souris est anesthésiée par une intrapéritonéale (ip) d'injection du mélange de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg). Puis les cheveux autour de la zone du muscle TA est éliminé par l'application de Nair à la jambe et d'attendre 30 secondes pour l'essuyer avec de l'eau distillée.
4. Alors que la souris est toujours sous anesthésie, 5x10 ⁵ cellules dans HBSS 10 ul sont injectés lentement dans chaque muscle TA à 3 points à l'aide d'une aiguille de calibre 30.
5. Après l'étape 4, la souris peut être régulièrement imagés par imagerie de fluorescence in vivo. L'imagerie de fluorescence station de NightOwl LB981 (Berthold Technologies, Inc), équipé d'une haute sensibilité à couplage de charge appareil, est utilisé pour obtenir des images à partir des jambes d'entraver des souris.
6. Le jour de l'imagerie in vivo, nous avons d'abord vérifier la repousse des cheveux sur le muscle TA. Si nécessaire, nous ré-appliquer Nair pour enlever les poils comme décrit ci-dessus, après avoir anesthésier la souris avec le mélange de kétamine et de xylazine.
7. Alors que la souris est sous anesthésie, nous plaçons la souris dans une position couchée sur un morceau de noir non fluorescent papier (papier noir Artagain de Strathmore). Pour bien exposer le muscle TA pour une meilleure imagerie, nous bande les pattes arrières sur le papier.
8. On place la souris dans la chambre de l'imagerie et la position de la patte postérieure à imager au centre du champ de vision de la caméra. Nous avons d'abord passer par le filtre d'émission de prendre un classique de gris image photographique de la jambe avec un temps d'exposition de 5 secondes. Réajuster la position de la souris et l'orientation de la caméra si nécessaire. Les paramètres d'imagerie, y compris le temps d'exposition (1250 ms), la hauteur des spécimens (0,9 cm), etc sont maintenus constants dans le processus expérimental.
9. Nous avons ensuite passer dans le filtre d'émission approprié pour la longueur d'onde la protéine fluorescente verte. Nous prenons l'image de fluorescence avec un temps d'exposition de 1.250 ms et un certain nombre de binning 1. Après l'imagerie, la souris est retirée de la chambre d'imagerie pour une cage d'attendre la récupération.
10. Pour l'analyse, nous tirons une région d'intérêt (ROI) sur les signaux fluorescents pour mesurer leur intensité en termes de photons par seconde. Nous mesurons également la taille du ROI en termes de nombre de pixels comme une autre valeur de quantification. Les expériences d'imagerie peut être répété chaque semaine ou plus souvent en quelques mois, si nécessaire, d'acquérir des données longitudinales.

A la fin des expériences, la souris est euthanasié et le muscle TA est récolté pour une analyse histologique.

Discussion

Nous mettons en place une plateforme d'imagerie fiable et stable pour le suivi de la fluorescence étiquetés cellules transplantées dans le muscle squelettique d'hôte dans cette étude. GFP-étiquetée myoblastes de souris transgéniques GFP représente un type de cellules souches adultes qui seront candidats pour la thérapie cellulaire à l'avenir. Une manipulation constante, y compris le nombre de cellules, l'injection de cellules, sur fond clair, la position de l'imagerie et le paramètre machine est important pour gagner la haute qualité d'image et surtout pour l'analyse quantitative.

L'imagerie par fluorescence a de nombreuses applications dans la recherche biomédicale comme il est non invasif, facile à utiliser, et a un débit élevé. En plus de l'imagerie de fluorescence peut fournir une mesure quantitative basée sur les comptages de photons, mais à cause de la dispersion, l'atténuation et l'absorption, la lumière ne peut pas pénétrer sur une grande distance dans les tissus, ce qui est une lacune de la technique. Des efforts ont été entrepris pour l'utilisation journaliste de rouge ou le proche infrarouge pour augmenter la profondeur de pénétration de la lumière.

Un autre avantage de l'imagerie de fluorescence, c'est qu'il est traduisible dans les cliniques si le journaliste fluorescente spécifique est approuvé pour usage humain. Par rapport à l'IRM, CT, et la TEP, imagerie de fluorescence a une grande flexibilité car elle ne nécessite pas de matériel coûteux et des agents d'imagerie. Un exemple est basées sur la fluorescence endoscope et les micro-endoscope qui ont été utilisés dans les cliniques. En combinant l'imagerie de fluorescence avec d'autres modalités, nous nous attendons à atteindre la capacité d'acquérir à la fois des informations anatomiques et fonctionnelles sur les processus biologiques sous-jacents.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NightOwl LB981	Berthold Technologies