Vi beskriver ett<em> In vivo</em> Fluorescens bildprotokoll att övervaka muskel förnyelse av GFP-märkta myoblasts efter transplantation till skelettmuskulaturen av både friska och dystrofisk möss. Detta protokoll kan anpassas för att studera muskler förnyelse genom transplantation av andra typer av celler och i andra muskulös förhållanden.
Muskeldystrofi är en grupp av degenerativa muskel sjukdomar som kännetecknas av progressiv förlust av kontraktila muskelceller. För närvarande finns ingen botande behandling att tillgå. Senaste framstegen inom stamcellsbiologi har genererat nya förhoppningar för att utveckla effektiva cellbaserade terapier för behandling av dessa sjukdomar. Transplantation av olika typer av stamceller märkta med fluorescerande proteiner i musklerna dystrofa djurmodeller har använts i stort sett i fält. En icke-invasiv teknik med möjlighet att spåra de transplanterade celler öde längden kan ytterligare vår förmåga att bedöma muskler engraftment av transplanterade celler mer noggrant och effektivt.
I den aktuella studien visar vi att in vivo fluorescens avbildning är en känslig och tillförlitlig metod för att spåra transplanterade GFP (grönt fluorescerande protein)-märkta celler i musen skelettmuskulaturen. Trots den oro bakgrunden på grund av användningen av ett externt ljus som behövs för excitation av fluorescerande proteinet, fann vi att med hjälp av antingen naken mus eller eliminera hår med reagenser hårborttagning mycket av detta problem elimineras. Med hjälp av en CCD-kamera, kan fluorescerande signal detekteras i tibialis anterior (TA) efter injektion av 5 x 10 5 celler från antingen GFP transgena möss eller EGFP transduced myoblast kultur. För mer ytliga muskler som extensor digitorum longus (EDL), injektion av färre celler ger en detekterbar signal. Signalstyrka kan mätas och kvantifieras som antalet utsända fotoner per sekund i en region av intresse (ROI). Eftersom de förvärvade Bilderna visar tydliga gränser som avgränsar engrafted området, kan storleken på ROI mätas också. Om ben placeras konsekvent varje gång, förändringarna i antalet fotoner per sekund per muskel och storlek på ROI återspegla förändringarna i antalet engrafted celler och storleken på engrafted området. Därför är de förändringar i samma muskel över tiden kan kvantifieras. In vivo fluorescerande bildteknik har använts främst för att spåra tillväxten av tumorogenic celler, visar vår studie att det är ett kraftfullt verktyg som ger oss möjlighet att spåra öde transplanterade stamceller.
Vi satte upp en tillförlitlig och stabil avbildning plattform för att spåra fluorescens märkt transplanterade cellerna i mottagarländerna skelettmuskulaturen i denna studie. GFP-märkta myoblasts från GFP transgen mus stöd för en typ av stamceller som kommer att vara kandidater för cellterapi i framtiden. En ständig manipulation, inklusive mobilnummer, cell injektion, tydlig bakgrund, bildbehandling position och maskinens parameter är viktig för att få hög bildkvalitet och speciellt för kvantitativ analys.
Fluorescens avbildning har många användningsområden inom den biomedicinska forskningen eftersom den är icke-invasiv, lätt att använda, och har en hög genomströmning. Dessutom fluorescens avbildning kan ge ett kvantitativt mått baserat på fotonen räknas, men på grund av spridning, dämpning och absorption kan ljuset tränga in inte ett stort avstånd i vävnad, vilket är en brist av tekniken. Insatser har pågått för att använda röd eller nära infraröda reporter att öka penetration av ljus.
En annan fördel med fluorescens avbildning är att det är att överföra till kliniker om den specifika fluorescerande reporter är godkänd för humant bruk. Jämfört med MR, CT och PET har fluorescens avbildning hög flexibilitet, eftersom det inte kräver dyr hårdvara och agenter avbildning. Ett exempel är fluorescens-baserade endoskop och mikro-endoskop som har använts på kliniker. Genom att kombinera fluorescens avbildning med andra modaliteter, förväntar vi oss att få möjlighet att få både anatomisk och funktionell information om de underliggande biologiska processerna.
Arbetet med Z-Yang och Y Wang har gjorts möjlig genom bidrag K02 AR051181 från NIAMS / NIH anslag från muskeldystrofi Association och Harvard Stem Cell Institute för Y Wang. Arbetet med Q Zeng och X Xu stöds av ett program för bidrag som beviljas för optisk avbildning Lab från Brigham and Women sjukhus. Författarna vill tacka Wen Liu från Department of anestesi, BWH för teknisk hjälp i cell arbete.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
NightOwl LB981 | Berthold Technologies |