Zebrafish शुक्राणु cryopreservation के लिए एक उच्च throughput और विधि इन विट्रो में निषेचन

Summary

इस zebrafish उच्च throughput के लिए एक शुक्राणु cryopreservation प्रोटोकॉल है. शुक्राणु cryopreserved इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर बाद में इन विट्रो निषेचन में 25% की प्रजनन क्षमता का एक औसत है और कई वर्षों से स्थिर है.

Abstract

इस zebrafish शुक्राणु cryopreservation के लिए एक तरीका है कि हार्वे विधि (हार्वे एट अल., 1982) का एक रूपांतर है. हम मूल प्रोटोकॉल के लिए दो बदलाव शुरू की है कि दोनों प्रक्रिया को कारगर बनाने और बढ़ाने के नमूना एकरूपता. सबसे पहले, हम सभी शुक्राणु ठंड मीडिया है कि cryoprotectant शामिल नहीं करता है का उपयोग मात्रा मानक के अनुसार. दूसरा, cryopreserved शुक्राणु केशिका ट्यूब की बजाय cryovials में संग्रहीत हैं. ठंड और विगलन (δ ° समय / सी) शुक्राणु की दर शायद दो सबसे महत्वपूर्ण चर करने के लिए इस प्रक्रिया में नियंत्रण कर रहे हैं. इस कारण से, विभिन्न ट्यूबों निर्दिष्ट उन के लिए विकल्प नहीं है. यह 2 की टीमों में कार्य करना संभव है ~ 2 घंटे में टीम के प्रति 100 पुरुषों के शुक्राणु फ्रीज. शुक्राणु cryopreserved इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर 25% की प्रजनन क्षमता का एक औसत है (इन विट्रो निषेचन में एक निषेचित अंडे की कुल संख्या से विभाजित में उत्पन्न व्यवहार्य भ्रूण की संख्या के रूप में मापा) और इस प्रतिशत प्रजनन क्षमता कई वर्षों से स्थिर है.

Protocol

एक भाग: शुक्राणु बर्फ़ीली समाधान 1. Ginsberg मछली Ringers (ताजा हर 3 दिन, Ginsburg, 1963) नोट: इसके अलावा के क्रम वर्षण रोकने के लिए महत्वपूर्ण है 450 में मिलीलीटर बाँझ ddH2O भंग: 3.25 छ NaCl KCl 0.125 जी CaCl2 • 2 H2O .175 छ फिर जोड़: NaHCO3 0.10 छ बाँझ ddH2O और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस के साथ 500 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाओ 2. बर्फ़ीली मध्यम (ताजा दैनिक बनाएं) मेथनॉल के बिना Ginsburg मछली 10 मिलीलीटर Ringers (कमरे Temp.) पाउडर स्किम दूध 1.5 ग्राम मेथनॉल के साथ नोट: इसके अलावा के क्रम वर्षण रोकने के लिए महत्वपूर्ण है Ginsburg मछली 9 मिलीलीटर (कमरे Temp) Ringers 1 मिलीलीटर मेथनॉल पाउडर पलटने 1.5 दूध छ ठंड मीडिया कोडांतरण के बाद, 20 मिनट के लिए मिश्रण अच्छी तरह से. कक्षीय प्रकार के बरतन या घुमाव पर. उपयोग करने से पहले, एक मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों में विभाज्य सतह बुलबुले से परहेज. भाग ख: शुक्राणु ठंड के लिए की जरूरत सामग्री शुक्राणु ठंड के लिए की जरूरत सामग्री 10 μl डिस्पोजेबल pipettes (Fisherbrand बिल्ली # 22-358697) मछली पानी के लिए 250ml beakers MESAB / Tricaine युक्त घड़ी चश्मा (Pyrex बिल्ली # 9985-75) P20 (या समतुल्य) pipetman और युक्तियाँ स्पंज मछली धारक (पुरुष पकड़ जबकि फैलाएंगे) ऊपर चरण प्रकाश व्यवस्था के साथ खुर्दबीन विदारक फ्लैट संदंश (जैसे Millipore प्रकार) 2.0ml क्रायोजेनिक शीशियों (Corning बिल्ली 430,488 #) 10×10 cryoboxes (Nalgene बिल्ली # 03-337-7AA) स्टायरोफोम कंटेनर ~ 15 सेमी पतले कुचल सूखी ice1 के साथ भरा 15 मिलीलीटर चोटीदार ट्यूबों (# फाल्कन 352,099) तरल नाइट्रोजन युक्त देवर कुप्पी लांग चिमटे (जैसे सीएमएस फिशर स्वास्थ्य देखभाल बिल्ली # 10-316B) Cryogloves पुरुषों के लिए रिकवरी टैंक एक Eppendorf ट्यूब मेथनॉल बिना ठंड मीडिया से भरा एक Eppendorf ट्यूब मेथनॉल के साथ ठंड मीडिया से भरा Cryofreezer (जैसे टेलर Warton कश्मीर श्रृंखला) 1 पतले कुचल सूखी बर्फ बनाने के लिए एक सरल तरीका यह एक तौलिया में लपेट और यह एक हथौड़ा के साथ टुकड़े टुकड़े करना है. एक अधिक कुशल पद्धति के लिए एक सूखी बर्फ बनाने की मशीन, जैसे Clawson मॉडल आरई 2 का उपयोग करने के लिए है. पार्ट सी शुक्राणु बर्फ़ीली विधि: केशिका ट्यूब मार्क: शुरुआत करने के लिए पहले, एक प्रयोगशाला कलम के साथ μl 3.33 के स्तर पर 10μl केशिका ट्यूब (यानी नीचे से 16.7 मिमी, चित्र देखें 1.1.) निशान . युक्त / MESAB tricaine () "Zebrafish बुक करें" में नुस्खा मछली पानी में पतला बीकर में प्लेस पुरुष (ओं): पुरुष anesthetize सूखी मछली: एक बार anesthetized, चतनाशून्य करनेवाली औषधि के बाहर मछली एक प्लास्टिक के चम्मच का उपयोग लिफ्ट और धीरे से एक कागज तौलिया पर सूखी मछली दाग, उदर पक्ष सुखाने के लिए विशेष ध्यान दे. जल शुक्राणु सक्रिय है इसलिए यह महत्वपूर्ण है अच्छी तरह से क्लोअका आसपास सूखी. स्पंज धारक पर स्थिति मछली, उदर पक्ष (1.2 छवि). यदि गुदा फिन के आसपास क्षेत्र अभी भी है नम, धीरे से एक kimwipe के साथ सूखी. समय से पहले निचोड़ नहीं शुक्राणु ख्याल रखना! रबर मुँह विंदुक एडाप्टर है कि केशिका ट्यूबों के साथ शामिल है प्लेस में केशिका ट्यूब चिह्नित. एडाप्टर है कि एक छोर पर एक मुखपत्र और दूसरे पर एक केशिका धारक है एक रबर नली है. वैकल्पिक रूप से, केशिका ट्यूब उचित व्यास के tygon टयूबिंग की एक छोटे टुकड़े के माध्यम से एक 50μl हैमिल्टन सिरिंज जुड़ा जा सकता है. गुंजाइश के तहत जगह पुरुष और ध्यान से पैल्विक पंख अलावा फैल केशिका ट्यूब के अंत का उपयोग करके मूत्रजननांगी खोलने बेनकाब. एकत्र शुक्राणु: धीरे चिकनी संदंश (जैसे Millipore) के साथ मछली के पक्ष पथपाकर द्वारा शुक्राणु निष्कासित, या धीरे अपने सूचकांक उंगली और अंगूठे के बीच मछली के पक्ष फैलाएंगे. लीजिए केशिका ट्यूब में शुक्राणु के रूप में यह कोमल चूषण (1.2 छवि) का उपयोग करने के लिए निष्कासित कर दिया है. मल है कि शुक्राणु के साथ निष्कासित किया जा सकता से बचें. 3.3 μl शुक्राणु की मात्रा मानक के अनुसार: यदि शुक्राणु पहुंचता है की मात्रा है, या केशिका ट्यूब (यानी 16.7 मिमी या अधिक) पर कलम निशान से अधिक है, तो चरण 8 के लिए आगे बढ़ें. यदि शुक्राणु की मात्रा लक्ष्य मात्रा तक पहुँच नहीं है, तो कलम रुक मध्यम मेथनॉल (1.3 छवि) बिना का उपयोग कर चिह्नित करने के लिए मात्रा मानक के अनुसार. शुक्राणु की न्यूनतम राशि है कि स्वीकार्य है शुक्राणु की गुणवत्ता के साथ बदलता रहता है. अच्छा शुक्राणु सफेद और अपारदर्शी है. गरीब शुक्राणु पानी दिखता है. 1 μl अच्छा शुक्राणु (या लक्ष्य 1 / 3) और 2 μl गरीब शुक्राणु (या लक्ष्य 2 / 3): सामान्य में, हम न्यूनतम के रूप में स्वीकार करते हैं. वॉल्यूम अब 3.3 μl सामान्यीकृत है. शुक्राणु को CRYOPROTECTANT जोड़ें: एम के साथ बर्फ़ीली मध्यम चूसोनारंगी चिह्न (; 1.4 छवि लगभग कुल मात्रा अब 20 μl है) के लिए इथेनॉल. एक घड़ी का शीशा साफ क्षेत्र पर शुक्राणु और cryoprotectant मिश्रण निष्कासित, बुलबुले परिचय नहीं विशेष ध्यान दे. धीरे ऊपर और नीचे pipetting ~ 4 बार () बुलबुले शुरू से बचने के द्वारा मिश्रण. 2 CRYOVIALS के प्रत्येक में 10μl शुक्राणु जगह: पिपेट शुक्राणु की 10 μl: दो अलग – अलग cryovials है कि प्रासंगिक जानकारी (1.5 छवि) के साथ चिह्नित किया गया है के तल में cryoprotectant समाधान. जल्दी से चल रहा है, टोपी शीशियों और उन्हें कमरे के तापमान 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूबों एक cryovial ट्यूब / के नीचे में ड्रॉप. कैप फाल्कन ट्यूब और कुचल सूखी बर्फ में cryovial युक्त फाल्कन ट्यूबों की जोड़ी सम्मिलित. 20 मिनट के लिए रुक शुक्राणु. शुष्क बर्फ पर: सूखी बर्फ ठीक पाउडर, छर्रों नहीं फार्म में होना चाहिए. ट्यूबों सूखी बर्फ में डाला जाना चाहिए गहरी पर्याप्त है कि केवल अपनी टोपियां दिखाने (1.6 छवि). आदेश में सूखी बर्फ में ट्यूबों का ट्रैक रखने के लिए, फाल्कन ट्यूबों के प्रत्येक जोड़ी 1-20 से एक नंबर (टोपियां पर लिखा) देने के लिए और समय वे सूखी बर्फ में जाने रिकॉर्ड. तरल नाइट्रोजन में जगह CRYOVIALS: के बाद शुक्राणु 20 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर जमे हुए है, उन्हें एक तरल नाइट्रोजन युक्त Dewar फ्लास्क को हस्तांतरण. शुक्राणु यहाँ तरल नाइट्रोजन फ्रीजर में जगह और समय तक संग्रहीत किया जाता है. जब फ्रीजर बक्से में रखकर में तरल नाइट्रोजन इतना है कि नमूनों गर्मी नहीं के एक स्नान में जगह फ्रीजर बॉक्स. लंबी धातु की चिमटे का प्रयोग Dewar फ्लास्क से शीशियों की वसूली और cryogloves के साथ संभाल. वैकल्पिक रूप से, cryovials सूखी बर्फ से सीधे स्थानांतरित कर सकते हैं फ्रीजर बॉक्स में अगर फ्रीजर बॉक्स एक स्टायरोफोम कंटेनर में तरल नाइट्रोजन में डूबे रखा है. एक क्रायोजेनिक तरल नाइट्रोजन फ्रीजर में स्टोर cryovials दीर्घकालिक. शुक्राणु की व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि शीशियों के तरल नाइट्रोजन में डूबे संग्रहीत किए जाते हैं. हमारे अनुभव में, भाप चरण में संग्रहीत शीशियों समय पर व्यवहार्यता खो देते हैं. स्पीड cryoprotectant जोड़ने और सूखी बर्फ में शुक्राणु शीशियों रखने (यानी 6-10 कदम) के बीच के समय कोई भी अधिक 30 सेकंड का होना चाहिए महत्वपूर्ण है. भाग डी में इन विट्रो निषेचन cryopreserved शुक्राणु पद्धति का उपयोग करके: हम पाते हैं कि यह दो लोगों के साथ सबसे अच्छा काम करता है. एक व्यक्ति को महिलाओं से अंडे का निचोड़ है जबकि दूसरे व्यक्ति शुक्राणु thaws. 33 सी. सेंटीग्रेड के एक पानी स्नान सेट तरल नाइट्रोजन फ्रीजर और हस्तांतरण से तरल नाइट्रोजन युक्त जब तक गल तैयार Dewar फ्लास्क cryovial निकालें. महिलाओं से 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में अंडे का निचोड़ है. यदि संभव हो, अंडे की 3 चंगुल प्राप्त करने के लिए और एक डिश में गठबंधन की कोशिश करो. यदि आप अपना पहला क्लच के 1 मिनट के भीतर तीन अच्छे चंगुल नहीं मिल सकता है, तो चरण 4 पर (एक अच्छा क्लच पर्याप्त है) आगे बढ़ना. अच्छा क्लच की परिभाषा:> 150 समान अच्छा लग अंडे (यानी पीले रंग के, कोई सफेद गिरावट के संकेत मलबे के साथ). कवर जबकि शुक्राणु thawed है पकवान रखें. शीशी को तरल नाइट्रोजन से निकालें और टोपी को हटा दें. 8-10 सेकंड के लिए 33 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जल्दी विसर्जित शीशी ~ 1 / 2 तरीका है. जल्दी शीशी और मिश्रण करने के लिए ऊपर और नीचे pipetting द्वारा 70 μl कमरे के तापमान हैंक्स जोड़ने. तुरंत अंडे को जोड़ने और विंदुक टिप के साथ धीरे मिश्रण. देरी के बिना, 750 μl मछली पानी जोड़कर शुक्राणु और अंडे को सक्रिय करें. मिश्रण भंवर. कमरे के तापमान पर 5 मिनट सेते हैं. 5 मिनट के बाद, मछली पानी और सेते पकवान के साथ 28 पर पकवान भरने डिग्री सेल्सियस 2-3 बजे के बाद भरोसा है, और 100mm व्यंजन (50/dish) के लिए उपजाऊ भ्रूण स्थानांतरण. बांझ अंडे गणना इतना है कि निषेचन आवृत्ति निर्धारित किया जा सकता है. लार्वा का अच्छा ख्याल रखना! पहले 5 दिनों के लिए, दैनिक पानी परिवर्तन और मृत भ्रूण को निकालने के. केवल लार्वा कि 5 दिन पर नर्सरी में तैरने bladders है रखो. पार्ट ई: प्रतिनिधि परिणाम हम इस crypreservation पद्धति का इस्तेमाल करने के लिए 2001 और 2003 के वर्षों के बीच tilling के लिए 8600 जमे हुए शुक्राणु के नमूने के एक पुस्तकालय बनाने के. हम इन नमूनों में से 106 thawed है और उनके प्रजनन निर्धारित है. फर्टिलिटी व्यवहार्य एक में इन विट्रो निषेचन अंडे कि जमे हुए शुक्राणु के साथ निषेचित किया गया की कुल संख्या से विभाजित में उत्पादित भ्रूण के अनुपात है. ताजा (cryporeserved गैर शुक्राणु) आम तौर पर> 95% की उर्वरता, cryopreserved शुक्राणु बहुत कम उर्वरता है: 29% (n = 106 शीशियों) के एक औसत है. प्रजनन क्षमता में शीशी को शीशी परिवर्तनशीलता बड़ा है, के रूप में कम से कम 1% से 62% के रूप में उच्च लेकर. इस परिवर्तनशीलता बड़ी त्रुटि छवि में मानक विचलन का प्रतिनिधित्व सलाखों द्वारा प्रतिनिधित्व किया है. 2. हालांकि 106 शुक्राणु तारीख हम दोनों शुक्राणु के नमूने में केवल एक बार 0% प्रजनन क्षमता का अनुभव करने के लिए इसी tilling उत्परिवर्तन ठीक करने में विफल रहा है thawed नमूनों में. (2001-2008) कई वर्षों के पाठ्यक्रम पर हमारे लाइब्रेरी से शुक्राणु शीशियों विगलन करके हमने पाया है कि इस विधि द्वारा जमे हुए शुक्राणु नमूने के औसत उर्वरता बनी हुई हैस्थिर समय के (छवि 2). 2001 में thawed जमे हुए शुक्राणु के नमूनों का औसत प्रजनन क्षमता 23.5% (11 शुक्राणु के नमूने पर आधारित) किया गया था और 2008 में 25% (21 शुक्राणु के नमूने पर आधारित) था. अन्य जांचकर्ताओं की एक संख्या अब अपनी प्रयोगशालाओं में कर रहे हैं इस शुक्राणु ठंड प्रोटोकॉल का उपयोग. प्रजनन दर और नमूना नमूना परिवर्तनशीलता हम क्या मनाया समान के साथ कुछ अच्छी सफलता की सूचना दी है. दूसरों को कथित तौर पर इस प्रोटोकॉल को अपने हाथों में काम करने में विफल रहा है. हम मानते हैं कि समस्याओं की संभावना स्रोत हैं: विफलता सटीक cryovials या शंक्वाकार ट्यूबों हम प्रोटोकॉल में सुझाव दिया है का उपयोग करें, ठंडा जब सूखी बर्फ में एक अलग दर के लिए अग्रणी; विफलता पाउडर सूखी बर्फ का उपयोग करने के लिए, एक ठंडा उप इष्टतम दर करने के लिए अग्रणी; गरीब प्रजनन के साथ पुरुष मछली का प्रयोग: आप एक एकल पुरुष से शुक्राणु के कम से कम 1 μl मिलना चाहिए. तुम भी ताजा शुक्राणु के साथ इन विट्रो निषेचन में कर रही द्वारा पुरुष प्रजनन क्षमता का परीक्षण कर सकते हैं, लेकिन यह गुमराह किया जा है, क्योंकि यह बहुत कम ताजा शुक्राणु लेता 100% की उर्वरता के पास मिल कर सकते हैं. में इन विट्रो निषेचन में उप मानक गुणवत्ता वाले अंडे का उपयोग करना. लेकिन कुछ भी सही चंगुल का उपयोग हमेशा 0% की उर्वरता के पास से भी शुक्राणु के नमूने है कि वास्तव में अच्छा प्रजनन क्षमता (डुप्लिकेट शीशी की उर्वरता के आधार पर) की ओर जाता है. चित्रा 1 शुक्राणु ठंड पद्धति के योजनाबद्ध. चित्रा 2. Cryopreserved शुक्राणु प्रजनन क्षमता समय पर स्थिर बनी हुई है. प्रतिशत प्रजनन क्षमता एक में इन विट्रो निषेचन अंडे कि जमे हुए शुक्राणु के साथ निषेचित किया गया की कुल संख्या से विभाजित में उत्पादित व्यवहार्य भ्रूण की संख्या है. N "" cryopreserved शुक्राणु शीशियों उर्वरता जिनकी इसी वर्ष में परीक्षण किया गया था की संख्या को संदर्भित करता है है. त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. चूंकि प्रत्येक शुक्राणु शीशी एक अलग पुरुष से है, शीशी को शीशी परिवर्तनशीलता मनाया जाता है.

Discussion

अन्य जांचकर्ताओं की एक संख्या अब अपनी प्रयोगशालाओं में कर रहे हैं इस शुक्राणु ठंड प्रोटोकॉल का उपयोग. कुछ इसी तरह की प्रजनन और एक ही नमूना नमूना परिवर्तनशीलता है कि हम देखा है की सूचना दी है. दूसरों को कथित तौर पर इस प्रोटोकॉल को अपने हाथों में काम करने में विफल रहा है. हम मानते हैं कि समस्याओं की संभावना स्रोत हैं:

1. विफलता सटीक cryovials या शंक्वाकार ट्यूबों हम प्रोटोकॉल में सुझाव दिया है का उपयोग करें, ठंडा जब सूखी बर्फ में एक अलग दर के लिए अग्रणी;
2. विफलता पाउडर सूखी बर्फ का उपयोग करने के लिए, एक ठंडा उप इष्टतम दर करने के लिए अग्रणी;
3. गरीब प्रजनन के साथ पुरुष मछली का प्रयोग: आप एक एकल पुरुष से शुक्राणु के कम से कम 1 μl मिलना चाहिए. तुम भी ताजा शुक्राणु के साथ इन विट्रो निषेचन में कर रही द्वारा पुरुष प्रजनन क्षमता का परीक्षण कर सकते हैं, लेकिन यह गुमराह किया जा है, क्योंकि यह बहुत कम ताजा शुक्राणु लेता 100% की उर्वरता के पास मिल कर सकते हैं. बड़े, अधिक robustly रंग पुरुषों को आमतौर पर और अधिक उच्च गुणवत्ता शुक्राणु दे.
4. में इन विट्रो निषेचन में उप मानक गुणवत्ता वाले अंडे का उपयोग करना. लेकिन कुछ भी सही चंगुल का उपयोग हमेशा 0% की उर्वरता के पास से भी शुक्राणु के नमूने है कि वास्तव में अच्छा प्रजनन क्षमता (डुप्लिकेट शीशी की उर्वरता के आधार पर) की ओर जाता है.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
10 μl disposable pipettes		Fisher	22-358697
Watch glasses		Pyrex	9985-75
2 ml cryogenic vials		Corning	430488
10 x 10 cryoboxes		Nalgene	03-337-7AA
15 ml conical tubes		Falcon	352099
Tongs		Fisher Health Care	10-316B
Cryofreezer		Taylor-Warton	K-series	For example