Een Multi-compartimenten CNS Neuron-glia Co-cultuur Microfluïdische Platform
Summary
We ontwikkelden een nieuw meerdere compartimenten neuron co-cultuur microsysteem platform voor in-vitro CNS axon-glia interactie onderzoek. Het platform is in staat het uitvoeren van maximaal zes onafhankelijke experimenten in parallel en werd vervaardigd met behulp van een nieuw ontwikkelde macro / micro hybrid fabricage methode.
Abstract
We presenteren een nieuw meerdere compartimenten neuron co-cultuur microsysteem platform voor in-vitro CNS axon-glia interactie tussen onderzoek, in staat is het uitvoeren van maximaal zes onafhankelijke experimenten in parallel voor een hogere throughput. Ontwikkelden we een nieuwe fabricage methode om microfluïdische apparaten met zowel micro-en macro-schaal structuren binnen het hetzelfde apparaat via een soft-lithografie-proces te creëren, waardoor de massa productie met een goede herhaalbaarheid.
De multi-compartimenten microfluïdische co-cultuur platform is samengesteld uit een soma compartiment voor neuronen en zes axon / glia vakken voor oligodendrocyten (OLS). De soma compartiment en axon / gliacellen compartimenten zijn met elkaar verbonden door arrays van axon-guiding microkanalen die functioneren als fysieke barrières voor neuronale soma beperken in de soma compartiment, terwijl axonen uit te groeien tot axon / glia compartimenten. OLS geladen in axon / glia compartimenten kunnen alleen communiceren met axonen, maar niet met neuronale soma of dendrieten, waardoor gelokaliseerde axon-glia interactiestudies. De microkanalen het ook mogelijk vloeibare isolatie tussen compartimenten, waardoor zes onafhankelijke experimenten worden uitgevoerd op een enkel apparaat voor een hogere doorvoersnelheid.
Soft-lithografie met behulp van poly (dimethylsiloxaan) (PDMS) is een veel gebruikte techniek in de biomedische Microdevices. Reservoirs op deze apparaten worden vaak bepaald door handmatig perforeren. Hoewel eenvoudige, slechte afstemming en tijdrovend karakter van het proces maakt dit proces niet geschikt wanneer grote aantallen reservoirs moeten herhaaldelijk worden gecreëerd. De nieuw ontwikkelde methode niet vereisen handmatige perforeren van de reservoirs, het overwinnen van dergelijke beperkingen. Eerste zeven reservoirs (diepte: 3,5 mm) werden gemaakt op een poly (methyl methacrylaat) (PMMA) blokkeren met behulp van een micro-freesmachine. Dan, arrays van nok microstructuren, gefabriceerd op een glazen substraat, waren hot-reliëf tegen de PMMA blok aan microkanalen dat de soma en axon / gliacellen compartimenten verbinden definiëren. Dit proces heeft geleid tot de macro-schaal reservoirs (3,5 mm) en micro-schaal kanalen (2,5 micrometer) te laten samenvallen in een enkele PMMA meester. Een PDMS replica die diende als een mal meester werd verkregen met behulp van soft-lithografie en het uiteindelijke PDMS apparaat werd gerepliceerd van deze meester.
Primaire neuronen van de E16-18 ratten werden geladen om de soma compartiment en gekweekt voor twee weken. Na een week van celkweek, axonen gekruist microkanalen en vormde axonale alleen netwerklaag binnen axon / glia compartimenten. Axonen groeide gelijkmatig in zes axon / glia compartimenten en OLS van P1-2 ratten werden toegevoegd aan axon / glia compartimenten op 14 dagen in vitro voor co-cultuur.
Protocol
Discussion
We hebben een multi-compartimenten co-cultuur platform voor het bestuderen van zoogdieren CNS axon-glia interactie. CNS axonen werden met succes geïsoleerd van neuronale cellichamen / dendrieten, en oligodendrocyten werden met succes samen gekweekt in het apparaat. Neuron dichtheid kan worden gevarieerd door toepassingen, maar te laag of te hoge concentratie kan leiden tot afsterven. Ook is het belangrijk om te veranderen maar de helft van de cultuur media, zodat de cellen of axonale laag op het substraat niet worden b…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health / National Institute of Mental Health (NIH / NIMH) te verlenen # 1R21MH085267.
References
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. 6, 683-690 (2005).
- Xia, Y., Whitesides, G. Soft Lithography. Angew. Chem. 37, 550-575 (1998).
- Taylor, A. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Methods. 2, 599-605 (2005).
- Li, J., Baud, O., Vartanian, T., Volpe, J. J., Rosenberg, P. A., A, P. Peroxynitrite generated by inducible nitric oxide synthase and NADPH oxidase mediates microglial toxicity to oligodendrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102, 9936-9941 (2005).
