Nous avons développé une nouvelle plateforme multi-compartiments microsystème neurone de co-culture in vitro du système nerveux central de recherche interactions axone-glie. La plateforme est capable de conduire jusqu'à six expériences indépendantes en parallèle et a été fabriqué en utilisant un tout nouveau micro / macro méthode de fabrication hybride.
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Article de méthode
Un compartiment Multi-SNC neurone-glie co-culture de la plate-forme microfluidique
Dans cet article
Résumé
Résumé
Nous présentons une nouvelle plateforme multi-compartiments microsystème neurone de co-culture dans la recherche in vitro l'interaction du système nerveux central axone-glie, capable de conduire jusqu'à six expériences indépendantes en parallèle pour débit plus élevé. Nous avons développé un procédé de fabrication afin de créer de nouveaux dispositifs microfluidiques ayant structures à l'échelle micro et macro dans le même dispositif à travers un simple processus de lithographie douce, permettant la fabrication de masse avec une bonne répétabilité.
Le multi-compartiments microfluidique plateforme de co-culture est composé d'un compartiment soma des neurones et six axone / glie compartiments pour les oligodendrocytes (OL). Le compartiment soma et axone / glie compartiments sont reliés par des réseaux de microcanaux de guidage des axones qui fonctionnent comme des barrières physiques pour confiner le soma des neurones dans le compartiment soma, tout en permettant aux axones de se développer en axone / compartiments glie. OL chargé dans l'axone / glie compartiments peuvent interagir uniquement avec les axones, mais pas avec le soma des neurones ou des dendrites, permettant des études d'interactions localisées axone-glie. Les microcanaux ont également permis l'isolement fluidique entre compartiments, laissant six expériences indépendantes pour être menée sur un seul dispositif pour un débit plus élevé.
Soft-lithographie utilisant le poly (diméthylsiloxane) (PDMS) est une technique couramment utilisée dans microdispositifs biomédicale. Réservoirs sur ces dispositifs sont communément définis par poinçonnage manuel. Bien que simple, un mauvais alignement et la nature du temps du processus rend ce processus ne convient pas quand un grand nombre de réservoirs doivent être reprises créé. La méthode nouvellement développée n'exigeait pas la perforation manuelle de réservoirs, de surmonter ces limitations. Tout d'abord, sept réservoirs (profondeur: 3,5 mm) ont été faites sur un poly (méthacrylate de méthyle) (PMMA) de bloc en utilisant une machine de fraisage une micro-. Ensuite, les tableaux de microstructures crête, fabriqué sur un substrat de verre, ont été à chaud en relief contre le bloc de PMMA de définir des microcanaux qui relient le soma et axone / glie compartiments. Ce processus a abouti à l'échelle macro-réservoirs (3,5 mm) et micro-échelle des canaux (2,5 um) pour coïncider avec un seul maître de PMMA. Une réplique de PDMS qui a servi en tant que maître moule a été obtenue en utilisant lithographie douce et le dispositif final PDMS a été reproduite à partir de ce maître.
Neurones primaires de rat E16-18 ont été chargés dans le compartiment soma et cultivées pendant deux semaines. Après une semaine de culture cellulaire, les axones traversé microcanaux et a formé des axones de la couche réseau seulement à l'intérieur des axones / glie compartiments. Les axones a grandi de façon uniforme partout dans six axone / glie compartiments et LO de P1-2 rats ont été ajoutés à l'axone / glie compartiments moins 14 jours in vitro pour la co-culture.
Protocole
Partie 1: Préparation d'un moule maître pour le multi-compartiment de fabrication de neurones périphériques de co-culture
- Première étape pour fabriquer le maître PMMA est de faire de 3,5 mm compartiments profonds. Un compartiment soma et six axone / glie compartiments sont définies sur un bloc de PMMA en utilisant une machine de fraisage une micro-(MDX-40, Roland ou tout autre fraiseuse CNC). PMMA maître est ensuite soniquée dans l'alcool isopropylique pendant 10 minutes pour enlever les débris.
- Des tableaux de structures um 2,5 haute crête sont modelés sur un mm 50,8 x 50,8 mm lame de verre par un procédé de photolithographie standard, s....
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Discussion
Nous avons développé un compartiment multi-plateforme de co-culture pour l'étude des mammifères SNC axone-glie interaction. Axones du SNC ont été correctement isolé de cellules neuronales organismes / dendrites, et les oligodendrocytes ont été co-cultivées avec succès à l'intérieur du dispositif. La densité des neurones peut être modifiée par les applications, mais la concentration trop faible ou trop élevé peut provoquer la mort des cellules. Aussi, il est important de changer seulement la moitié des milieux de.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health / National Institute of Mental Health (NIH / NIMH) accorder # 1R21MH085267.
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Références
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. 6, 683-690 (2005).
- Xia, Y., Whitesides, G. Soft Lithography. Angew. Chem. 37, 550-575 (1998).
- Taylor, A.
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Réimpressions et autorisations
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