Cette vidéo-article décrit, étape par étape, comment traiter un échantillon de sperme d'atteindre une bonne qualité de fluorescence In situ sur les spermatozoïdes humains. Préparations obtenues peuvent être utilisées pour le dépistage d'aneuploïdie dans le contexte du diagnostic clinique.
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Article de méthode
Fluorescence In situ (FISH) du Protocole dans le sperme humain
Dans cet article
Résumé
Résumé
Aneuploïdies sont les anomalies les plus fréquentes chromosomiques chez l'homme. La plupart de ces anomalies résultent d'erreurs durant le processus de la méiose gamétogènes chez les parents. Dans les mâles humains, ces erreurs peuvent conduire à la production de spermatozoïdes avec des anomalies chromosomiques numériques qui représentent un risque accru de transmission de ces anomalies à la descendance.
Pour cette raison, la technique de l'hybridation fluorescente in situ (FISH) sur noyaux de spermatozoïdes est devenu un protocole largement intégrées dans le contexte du diagnostic clinique. Cette pratique donne une estimation de la fréquence des anomalies chromosomiques numériques dans les gamètes des patients qui cherchent des conseils de reproduction génétique.
À ce jour, les chromosomes les plus fréquemment inclus dans l'analyse FISH des spermatozoïdes sont les chromosomes X, Y, 13, 18 et 21.
Cette vidéo-article décrit, étape par étape, comment traiter et résoudre un échantillon de sperme humain, comment decondense et dénaturer la chromatine des spermatozoïdes, la façon de procéder pour obtenir les préparations de poisson du sperme, et la façon de visualiser les résultats au microscope. Remarque spéciale sur les étapes les plus pertinents sont donnés pour atteindre les meilleurs résultats.
Protocole
Le traitement des échantillons et la fixation des cellules I.
- Laisser l'échantillon de sperme dans des contenants stériles à température ambiante pendant 20 minutes jusqu'à liquéfaction.
- Transférer l'échantillon dans un tube de centrifugeuse et il tourne à 1000g pendant 5 minutes.
- Retirer délicatement et jeter le surnageant à l'aide d'une pipette Pasteur.
- Ajouter une solution hypotonique (KCl, 0,075 M) pré-chauffé à 37 ° C, goutte à goutte, tout en mélangeant sur un vortex pour obtenir un volume final de 10 ml.
- Placer le tube dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 30 minutes.
- Centrifuge....
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Discussion
Ce protocole décrit comment traiter les échantillons de sperme de l'homme pour obtenir les préparations de poisson sperme. L'utilisation de ce protocole, il est possible d'analyser des anomalies chromosomiques dans les gamètes mâles. Les spermatozoïdes aneuploïdie de dépistage a des applications soit dans le contexte de la recherche fondamentale et dans les conseils de reproduction donnée aux hommes infertiles. Bien que dans le diagnostic clinique des chromosomes les plus étudiées sont X, Y, 13, 18 et 21, d&.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Les auteurs remercient J. Blanco et F. Vidal pour leur supervision et d'encouragement, et J. Lucas pour son assistance technique.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| 1,4-dithiothréitol (DTT) | Matériel | Roche Group | 10197777001 | |
| 2-Amino-2-(hydroxyméthyl)-1,3-propanediol | Matériel | Groupe Roche | 10708976001 | |
| Acide acétique | Matériel | Merck & Co., Inc. | 100.063 | |
AneuVysion® Kit de sondes d'ADN multicolores
| Matériel | Vysis Inc. | 32-161075
| |
| Centrifugeuse 5804R | Outil | Eppendorf | ||
| Tube à centrifuger | Matériel | Nalge Nunc international | 347856 | |
| bocal de Coplin (verre) | Matériel | Barloworld Scientific | Hellendahl (ZCT278) | |
| bocal de Coplin (plastique) | Matériel | Deltalab | 191087 | |
| Coverslips (15x15) | Matériel | Knittel Glaser | 4600115 | |
| Coverslips (18x18) | Matériel | Knittel Glaser | 4600118 | |
| Crayon diamant | Matériel | Hammacher | 335117010 | |
| Éthanol | Matériel | Merck && Cie, Inc. | 100.983 | |
| Formamide | Matériel | Roche Group | 11814320001 | |
| Congélateur | Outil | Zanussi | ||
| Gants | Matériel | Sanyo | 101/3300 | |
| HYBrite™ | Outil | Vysis Inc. | ||
| Huile à immersion | Matériel | Olympus Corporation | 35505 | |
| Incubateur | Outil | Heraeus Instruments | ||
| Méthanol | Matériel | Merck && Cie, Inc. | 106.009 | |
| Micropipette | Matériel | Labsystems | Finnpipette (4500000) | |
| Embouts jetables pour micropipette | Matériel | Daslab | 16-2001 | |
| Vernis à ongles | Matériel | Quo-cosmétiques | ||
| Microscope à épifluorescence Olympus BX60 | Outil | Olympus Corporation | Équipé d'un filtre triple bande pour DAPI/Texas Red/FITC et de filtres mono-bande pour Aqua, FITC et Texas Red. | |
| Pipette Pasteur | Matériel | Rubilabor | 211.0230 | |
| Microscope à contraste de phase | Outil | Nikon Instruments | ||
| Pipette en plastique (3 ml) | Matériel | Deltalab | 200007 | |
| Chlorure de potassium (KCl) | Matériel | Fluka | 60128 | |
| Ciment caoutchouc | Matériel | Meilleur test | ||
| Lames porte-lames | Matériel | Knittel Glaser | 4520022 | |
| Boîtes de protection pour lames | Matériel | Deltalab | 19276.1 | |
| Récipient stérile | Matériel | Deltalab | 409726 | |
| Seringue | Matériel | PentaFerte | 002022300 | |
| Thermomètre | Matériel | Comark Instruments, Inc | KM12 | |
| Eau tri-destillée | Matériel | |||
| Triton X-100 | Matériel | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Pinces | Matériel | B. Braun Medical | Aesculap (BD224R) | |
| Laminaire vertical hotte à flux laminaire | Outil | Burdinola | OR-ST 1500 | |
| Agitateur vortex | Outil | Fisher Scientific | FB15012 | |
| Bain-marie | Outil | Raypa® |
Références
- Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).
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