Nous décrivons ici un protocole de base pour le marquage fluorescent des différents éléments de tubes coeur de la larve et l'adulte Drosophila melanogaster. Ces spécimens sont bien adaptés pour l'imagerie par microscopie fluorescente ou confocale. Cette technique permet une analyse détaillée des caractéristiques structurelles des cœurs d'un organisme modèle puissant.
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Dans cet article
Résumé
Protocole
Avant de commencer
- Préparer les solutions suivantes:
- mémoire tampon de détente (artificielle drosophile hémolymphe (ADH) (voir "Visualisation du cœur battant de la drosophile") qui contient 10 mM EGTA)
- fixateur (formaldéhyde à 4% dans du PBS 1X)
- PBSTx (PBS contenant 0,1% de Triton-X-100)
- Convenablement diluée primaire et spécifique à l'espèce marqué par fluorescence des anticorps secondaire dans PBSTx
- Disséquer la drosophile pour exposer les tubes cardiaques (des mouches adultes et / ou larves) suite
- le protocole....
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Discussion
Nous présentons ici un protocole utile pour la préparation et la coloration du navire Drosophila melanogaster dorsale et des tissus attenants à l'imagerie par microscopie fluorescente ou confocale. Nous fournissons un compte rendu concis des étapes affiné par et couramment employées dans notre laboratoire pour la coloration efficace qui permet de bien résolu à l'imagerie in situ de la larve et adulte tubes cardiaques chez la drosophile. D'autres ont décrit des méthodes similaires s.......
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Remerciements
Les auteurs remercient SI Bernstein (San Diego State University) pour une lecture critique et des suggestions utiles concernant la préparation de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH pour SI Bernstein, SDSU, et à R. Bodmer, BIMR, et par une bourse post-doctorale de l'affiliation Ouest des États de l'American Heart Association à G. Vogler et à A. Cammarato.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| Acide éthylène glycol-bis (2-aminoéthyléther) -N,N,N’,N’-tétra-acétique (EGTA) | Réactif | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Formaldéhyde, 10 %, sans méthanol, Ultra Pur | Réactif | Polysciences, Inc. | 50-00-0 | |
| Triton X-100 | Réactif | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| Alexa Fluor® 594 phalloïdine | Réactif | Invitrogen | A12381 | |
| Milieu de montage Vectashield® pour la fluorescence avec DAPI | Réactif | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Épingles en tungstène | Réactif | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Support d'épingle | Réactif | Fine Science Tools | 26018-17 |
Références
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. , (2009).
- Molina, M. R., Cripps, R. M. Ostia, the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech Dev. 1, 51-59 (2001).
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Réimpressions et autorisations
