Detta protokoll visar hur att bevara friska, odifferentierade embryonala stamceller (ES-celler).
Mänskliga embryonala stamceller (HES) celler måste övervakas och vårdas för att bibehålla friska, odifferentierade kulturer. Vid minst måste de kulturer matas varje dag genom att utföra en komplett medelstora förändring för att fylla på förlorade näringsämnen och för att hålla kulturer fri från oönskad differentiering faktorer. Även en liten mängd av differentiering är normalt och förväntat i kulturer stamceller bör kultur rutinmässigt saneras genom att manuellt ta bort, eller "plocka" differentierade områden. Identifiera och ta bort överskott differentiering från hES cellkulturer är viktiga tekniker för att upprätthålla en frisk population av celler.
Sterilitet måste underhållas hela tiden när man arbetar med HES celler. Rengör och sterilisera biologisk säkerhet skåp och all utrustning före användning. Alla reagenser måste filtreras med hjälp av en 0,22 ìm porstorlek filtret före användning. Användningen av antiboiotics vid HES cellkultur är inte nödvändig och bör undvikas.
En separat miljö bör inrättas som en designerad plocka station. Den sterila kapsling för stationen kan vara en statisk inhägnad (t.ex. ett PCR-arbetsstation) med en UV-ljuskälla, ett laminärt flöde huva, eller en biologisk säkerhet skåp. En dissekera mikroskop inuti plocka stationen behövs för att observera de kolonier som de differentierade områden tas bort. Den främre glas panel en statisk inhägnad eller ett biologiskt säkerhetsbänk måste ändras för att möjliggöra okularen i mikroskop för att förlänga genom panelen utan att kompromissa korrekt luftflöde och sterilitet.
För att bibehålla sunda hES cellodlingar, måste cellerna passerats vid den optimala tidpunkten, typiskt var 4-7 dagar. Vid denna tid kolonierna har nått sin maximala storlek och kan börja gå samman. Sammanslagna kolonier kan öka graden av differentiering i kulturen. Split nyckeltal faller i allmänhet från 1:03 till 01:05, beroende på antalet kolonier pläterade, expansionstakt och villkor kultur. Overplated kolonier (delningsfaktorn för låg) kommer sannolikt att slås samman för tidigt och måste passerats innan de når sin maximala storlek.
Kulturer på en MEF matare lager som är mer än 2 veckor gamla måste passerats på nya MEFs som kommer att stödja odifferentierad tillväxt och spridning.
Sedan differentiering naturligt i hES cellkulturer, är en liten summa förväntas. Frekvent eller överdriven differentiering kan uppstå om de kulturer inte får lämplig vård. Cellerna måste matas varje dag, bör överväxt mellan passager undvikas. Använd alltid färska reagenser. Alla medier, MEFs och reagenser måste användas inom 14 dagar för att undvika odifferentierade hES celltillväxt. Nya massor av reagens, som Knockout Serum Replacement, FBS och MEFs, bör säkerhetskontrolleras innan användning. Kom ihåg att alla differentierade celler inte avlägsnas före passaging kommer att överföras till den nya kulturer. Försök också att hålla cellerna vid 37 ° C när det är möjligt. Minimera den tid de celler tillbringar utanför kuvösen (t.ex. på mikroskop scenen eller i den biologiska säkerhetsskåp.) En uppvärmd mikroskop skede kan vara mycket fördelaktigt om cellerna kommer att vara av inkubatorn under längre perioder.
När observera hES cellkulturer i mikroskop, först bedöma den övergripande kvaliteten och storleken på kolonierna vyn med en låg effekt (2x eller 5x) mål. Om potentiellt differentierade celler observeras vid låg effekt, bekräfta de differentierade morfologi med hjälp av en högre förstoring mål (10X).
Omedelbart efter att ta bort differentiering kan kanterna av kolonierna hackiga eller skadade. Inkubera kolonierna natten i nya medium till att återstående odifferentierade celler att återhämta sig. Utan påverkan av differentiering i kulturen, kommer dessa kvarvarande kolonier fortsätta att föröka sig normalt.
Om möjligt, börja experiment med låga passagen hES celler. Karyotyp cellerna före och efter alla större experiment.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
D-MEM | Invitrogen | 11965-092 | For MEF medium | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Certified | Invitrogen | 16000-044 | Heat-inactivated For MEF medium |
|
D-MEM/F-12 | Invitrogen | 11330-057 | ||
Knockout™ Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Pre-screen to ensure support of hES cells | |
bFGF | Stemgent | 03-0002 | Use at [4 ng/mL] final | |
Non-essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-050 | ||
L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 200 mM (100X) Use at [1X] final |
|
PBS | Invitrogen | 14190-250 | Without Ca2+ or Mg2+ | |
Collagenase IV | Invitrogen | 17104-019 | Make a fresh solution at 1 mg/mL in D-MEM/F-12 | |
Gelatin | Sigma | G1890 | Type A, Porcine | |
Fetal Bovine Serum (FBS), Defined | HyClone | SH300.70.01 | For freezing medium | |
6-well plates | Nunc | 140675 | For general culture | |
4-well plates | Nunc | 176740 | For thawing | |
5 mL glass pipets | Fisher | 13-678-27E | Individually wrapped | |
15 mL conical tubes | Corning | 430052 | Polypropylene | |
Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20D | 9” glass |