डीएनए की ए Biotinylation प्लास्मिड डीएनए covalently guanine विशेष बायोटिन के रूप में निर्माता द्वारा वर्णित (Mirus जैव, मैडिसन, WI) लेकिन ~ 1-2 डीएनए प्रति बायोटिन लेबल पहुंचा लेबल के साथ biotinylated थे. प्लास्मिड डीएनए (pEGFP-C1, 4.9 केबी, Clontech, माउंटेन व्यू, सीए) इस प्रोटोकॉल में चिह्नित किया गया. DNase मुक्त और RNase मुक्त ते बफर (आणविक जीव विज्ञान ग्रेड गुणवत्ता) पानी में pDNA के वांछित राशि को भंग करने के लिए एक 1μg/μL डीएनए समाधान बनाने के लिए. आचरण लेबलिंग प्रतिक्रिया निम्नलिखित प्रतिक्रिया मिश्रण का उपयोग. लेबल आईटी अभिकर्मक पिछले जोड़ें. 100μg डीएनए प्रतिक्रिया के लिए: DNase मुक्त और RNase मुक्त पानी 75 μL 10X लेबल बफर एक 20 μL 1μg/μL डीएनए 100 μL आईटी अभिकर्मक लेबल 5 μL कुल मात्रा 200 μL 37 पर प्रतिक्रिया ° सी 1 घंटे के लिए सेते हैं. शुद्ध इथेनॉल या मानक प्रोटोकॉल का पालन isopropanol तेज़ी से लेबल नमूना. नोट: जेल निस्पंदन आधारित स्तंभों को उच्च यूवी absorbance या प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि, जो डीएनए की मात्रा का ठहराव या प्रतिदीप्ति लक्षण वर्णन को प्रभावित कर सकता करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. नोट: biotinylation के स्तर HABA आधारित परीक्षण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. Cy5 – Cationic पॉलिमर के बी लेबल Chitosan (390 केडीए, 83.5% deacetylated, Vanson, रेडमंड, WA) इस अध्ययन में एक मॉडल cationic बहुलक के रूप में इस्तेमाल किया गया था. chitosan बहुलक रीढ़ की हड्डी पर मुफ्त प्राथमिक amines Cy5 – एन एच एस (Amersham बायोसाइंसेज, Piscataway, न्यू जर्सी) के साथ लेबल रहे थे. Cy5 डाई की पूरी संयुग्मन की सुविधा के लिए, Cy5 – एन एच एस के लिए आवश्यक राशि की गणना जैसे कि Cy5 की दाढ़ अनुपात: 200: प्राथमिक amines 1 है. 6.5 ~ NaOH के अलावा द्वारा chitosan के समाधान के पीएच (25mm एसीटेट बफर में) को समायोजित करें. ध्यान दें कि एनएचएस प्रतिक्रिया बुनियादी पीएच में अधिक कुशल है, लेकिन यहाँ विलेयता chitosan के काम पीएच रेंज सीमा. जबकि भावप्रवण, धीरे धीरे chitosan के समाधान के लिए एक तरीके से ड्रॉप द्वारा ड्रॉप में Cy5 एनएचएस (1 मिलीग्राम / मिलीलीटर DMSO) की गणना की राशि जोड़. अंधेरे में मिश्रण कमरे के तापमान पर रातोंरात आंदोलन. शुद्ध करने के लिए, 1% अंधेरे में कमरे Temp पर एसीटेट बफर के खिलाफ 2 घंटा के लिए 10k MWCO स्लाइड – एक Lyzer (पियर्स) के साथ dialyze. बफर और अंधेरे में कमरे Temp पर एक और 2 घंटा dialyze बदलें. बफर और 4 में रात dialyze ° सी अंधेरे में बदलें. स्टोर शुद्ध -20 डिग्री सेल्सियस पर बहुलक लेबल नोट: इस अध्ययन में, एक मानक वक्र 670 एनएम Cy5 – एनएचएस एस्टर के उत्सर्जन की तीव्रता को मापने के द्वारा निर्मित है. 670 एनएम Cy5 लेबल chitosan से मानक वक्र में प्राप्त उत्सर्जन को मापने के द्वारा लेबलिंग घनत्व विशेषताएँ. Absorbance भी लेबलिंग दक्षता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है लेकिन यहाँ प्रदर्शन किया गया था नहीं. QD लेबल डीएनए और Cy5 पॉलिमर सी. तैयारी pDNA की दाढ़ QD अनुपात अधिक में रखा गया था (pDNA: QD ≈: 1 2) QDs का पूरा pDNA संयुग्मन सुनिश्चित करने के लिए. प्रत्येक pDNA पर लेबल QDs की संख्या इमेजिंग मंदिर या अन्य समकक्ष सुविधाओं के माध्यम से अनुमान लगाया जा सकता है. हमारे अध्ययन में, pDNA प्रति QDs की संख्या होने का अनुमान है ~ मंदिर और एक अणु स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा 1-3 1 का प्रयोग करें Millipore मिल्ली क्यू तैयारी के दौरान ढाल पानी (> 18.0 मेगावाट, 0.2um फ़िल्टर). Chitosan के लिए आवश्यक राशि 10μg pDNA के लिए वांछित अनुपात एन / पी के अनुसार, chitosan के समाधान में डीएनए समाधान में नकारात्मक फॉस्फेट protonated amines के सैद्धांतिक अनुपात की गणना. Biotinylated pDNA समाधान में streptavidin functionalized 605QDs (605 Qdot ITK, Invitrogen, Carlsbad, CA के) जोड़ें. 15 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर समाधान सेते हैं. अंतिम मात्रा 200μL बनाने के लिए 50 मिमी सोडियम सल्फेट समाधान में QD-लेबल डीएनए जोड़ें. Cy5 chitosan पतला, वांछित अनुपात एन / पी के अनुसार, मिल्ली क्यू पानी के साथ अंतिम मात्रा 200μL बनाने. नोट: अंधेरे में प्रतिक्रिया के लिए संभव photobleaching को रोकने रखें . महत्वपूर्ण: Qdot 605 ITK ™ streptavidin संयुग्म (ITK श्रृंखला), के रूप में इस सूची में क्वांटम डॉट्स झल्लाहट के प्रयोजन के लिए डिजाइन कर रहे हैं का उपयोग करने के लिए सावधान रहो. नियमित Qdot श्रृंखला खूंटी सेलुलर लेबलिंग के लिए विशेष रूप से गैर विशिष्ट बंधनकारी, को रोकने के परत के साथ संयुग्मित कर रहे हैं. हालांकि, इस अतिरिक्त कोटिंग दूरी दाता स्वीकर्ता मायनों में इजाफा होगा, r में जिसके परिणामस्वरूपऊर्जा स्थानांतरण क्षमता educed. डी. निर्माण SU-8 मानक Photolithography का प्रयोग मास्टर्स सी वफ़र पिरान्हा साफ और 200 पर डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए बेक किया हुआ है. नामित 25μm के मालिक मोटाई, स्पिन कोट 2000 rpm पर सी वफ़र पर नकारात्मक (2025 SU-8, Microchem, न्यूटन, एमए) 30 सेकंड के लिए photoresist के लिए. शीतल 65 के एक रैंप के साथ एक hotplate पर वफ़र सेंकना ° सी / 95 के लिए घंटा डिग्री सेल्सियस 2 250mJ/cm के लिए एक मुखौटा (सीएडी / कला सेवाएँ, Bandon, या) फिल्म microchannels की डिजाइन से युक्त के माध्यम से यूवी प्रकाश (365nm) के लिए बेनकाब. प्रदर्शन के बाद 65 साल की एक रैंप के साथ एक hotplate पर वफ़र सेंकना ° सी / 95 के लिए घंटा डिग्री सेल्सियस वफ़र SU-8 photoresist डेवलपर का उपयोग का विकास करना. नमूनों वफ़र मुश्किल से 65 साल की एक रैंप के साथ एक hotplate पर पके हुए ° / सी 200 से घंटा डिग्री सेल्सियस 200 ° सी में कम से कम 5 घंटे के लिए वफ़र बनाए रखें, तो धीरे – धीरे वफ़र कमरे के तापमान को शांत. महत्वपूर्ण: के दौरान क्रमिक ramping SU-8 अन्यथा मास्टर पाक प्रक्रिया के लिए आवश्यक है, SU-8 संरचना सिलिकॉन वफ़र या दरारें से अलग हो सकता है SU-8 संरचना तनाव रिलीज द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. PDMS ई. प्रतिकृति स्वामी और संबंध से कवर ग्लास के लिए मोल्डिंग SU-8 मास्टर एक वजन नाव में रखा गया है. मिक्स सिलिकॉन elastomer और इलाज एक 10 में ((dimethylsiloxane) पाली, PDMS, Sylgard 184, डॉव Corning, मिडलैंड, एमआई) एजेंट: 1 अनुपात. SU-8 मास्टर पर PDMS मिश्रण डालो और बुलबुले को दूर करने के लिए एक निर्वात desiccator में वजन नाव छोड़. 65 ° सी में 1-2 घंटे के लिए चिकित्सा PDMS. सी मास्टर मोल्ड से PDMS पट्टी पील. पंच चैनल inlets और fluidic डिवाइस के आउटलेट. PDMS पट्टी और कवर ग्लास और इथेनॉल के साथ फिर हवा सूखी साफ. साफ PDMS पट्टी और कवर गिलास ऑक्सीजन प्लाज्मा (20W 1min के लिए) के साथ समझो. तुरंत बंधन कवर गिलास के साथ PDMS पट्टी. 95 पर ° रात भर के लिए सी ओवन में बंधुआ microfluidic चिप छोड़ो. महत्वपूर्ण: प्लाज्मा उपचार और रातोंरात पाक बढ़ाया संबंध ताकत के लिए आवश्यक हैं. एफ microfluidic डिवाइस में डीएनए Nanocomplexes के गठन मॉनिटर पानी के साथ microfluidic चैनल (करने के लिए सुनिश्चित करें microfluidic चैनल के अंदर कोई बुलबुले) अभिकर्मकों लोड हो रहा से पहले प्रयोग के दौरान निर्बाध प्रवाह को सुनिश्चित करने के लिए, भरें. दो व्यक्ति कांच सीरिंज में QD लेबल डीएनए और Cy5 लेबल chitosan समाधान, वीडियो में वर्णित टयूबिंग के माध्यम से लोड करें. Microfluidic उपकरणों के दो inlets के साथ टयूबिंग कनेक्ट. प्रक्रिया के दौरान किसी भी हवा परिचय नहीं सावधान रहो. 20nL/min (पीएचडी-2000 सिरिंज पंप, Holliston, एमए) में प्रवाह दर, लामिना का प्रवाह शर्तों के तहत निर्धारित करें. खुर्दबीन के नीचे microchannels की जाँच करें. जब प्रवाह (~ 15 से 20 मिनट) स्थिर है, QD की मध्यस्थता झल्लाहट चैनल के केंद्र में मनाया जाना चाहिए. चैनल के साथ विभिन्न स्थानों पर प्रतिदीप्ति चित्रों (कूल्ड सीसीडी, QImaging, ई.पू., कनाडा) ले लो. ImageJ और OriginLab साथ छवियों प्रतिदीप्ति विश्लेषण. चित्रा 1. QD-झल्लाहट डीएनए विधानसभा स्वयं Nanocomplexes के शुरू होने के एक संवेदनशील संकेत प्रदान करता है क्वांटम डॉट मध्यस्थता प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (QD झल्लाहट -), डीएनए और जीन के वाहक के बीच बातचीत की शुरुआत की स्पष्ट का पता लगाने के लिए अनुमति देता है या तो अतिरिक्त या अंतर सेलुलर वातावरण में पॉलीप्लेक्स स्थिरता का एक मात्रात्मक और बेहद संवेदनशील संकेत प्रदान कर सकते हैं. जोड़ी झल्लाहट, 605QD और Cy5, दाता और स्वीकर्ता के बीच वर्णक्रमीय ओवरलैप अधिकतम और संभावित पार बात कम से कम के आधार पर चुना गया था. इस जोड़ी के लिए, Forster दूरी 69.4Å है 3 . QD-झल्लाहट डीएनए nanocomplexes के विधानसभा स्व. Anionic प्लाज्मिड (pDNA) डीएनए और cationic जीन वाहक (ऊर्जा दाता) QD और Cy5 (ऊर्जा स्वीकर्ता) के साथ लेबल रहे थे, क्रमशः. QD-झल्लाहट nanocomplexes electrostatic जटिल coacervation के माध्यम से गठन किया गया. 488 एनएम पर उत्तेजना होने पर, QD-झल्लाहट की मध्यस्थता Cy5 उत्सर्जन एक कॉम्पैक्ट और बरकरार nanocomplex के गठन का संकेत दिया. निवास समय (टी आर) (x) जो दूरी से जहां दो धाराओं जांच के तहत प्रतिक्रिया की स्थिति, और मतलब प्रवाह गति (v) से मिलने उपाय के अनुसार गणना की जा सकती है . लामिना का प्रवाह की प्रकृति के कारण, मिश्रण केवल इंटरफ़ेस (प्रत्येक छवि के केंद्र) पर जगह लेता है, टी आर के एक समारोह के रूप में बड़े पैमाने पर परिवहन की सटीक गणना की अनुमति. टेम्पोरल संकल्प applie अलग से समायोजित किया जा सकता हैघ प्रवाह दरों. (इनसेट) झल्लाहट मध्यस्थता संकेत इंटरफ़ेस जब मिले दो धाराओं पर तुरंत मनाया गया, यह दर्शाता है कि बाध्यकारी तेजी से गया था, लागू प्रवाह दरों के लिए अनुसार कुछ milliseconds के भीतर होने वाली. स्केलपट्टी: 100μm.