Isolamento e manipulação genética de adultos miócitos cardíacos for Imaging Confocal
Summary
Adulto miócitos cardíacos são células primárias que podem ser isoladas de corações de animais e cultivados por vários dias. Dentro deste período a cultura de transferência de gene adenoviral podem ser usadas para expressar biossensores geneticamente codificado (GEBS) ou proteínas de fusão fluorescente. Ambas as abordagens permitem investigações celular por meio de microscopia confocal.
Abstract
Miócitos cardíacos isolados de corações adultos são amplamente aceitos como um modelo em algum lugar a meio caminho entre as células musculares embrionárias e neonatal de um lado e um coração trabalho, por outro. Assim, cardiomiócitos servir como bons modelos para a fisiologia celular cardíaca e fisiopatologia, para as investigações farmacêuticos, bem como para a exploração de modelos animais transgênicos. Aqui nós descrevemos um método de isolar as células do coração. Além disso, mostramos como uma manipulação genética em miócitos cardíacos pode ser realizada sem criação de um animal transgênico: Esta é a combinação da cultura a longo prazo (uma semana) e transferência de genes adenovirais. O último é descrito a partir da construção do vírus para a transdução das células. Ele pode ser usado para a expressão de biossensores geneticamente codificado (GEBS), proteínas de fusão fluorescentes, mas também para a proteína mais expressão e regulação, por exemplo, usando RNAi. Aqui nós fornecemos um exemplo para a expressão de uma proteína de fusão coloração de uma estrutura subcelular (Golgi). Expressão da proteína como pode ser visualizado por imagem confocal de z-pilhas para uma reconstrução 3D de estruturas celulares. O protocolo compreende o estado-da-arte em cultura de células, biologia molecular e biofísica e, portanto, oferece uma abordagem para explorar novos horizontes em cardiologia celular.
Protocol
Discussion
O procedimento descrito para o isolamento de cardiomiócitos de rato pode ser adaptado para outras espécies, por exemplo, mouse 4, se necessário. Um parâmetro que as necessidades de adaptação é a mistura de enzimas para a digestão (veja abaixo) e também a duração da digestão. Estar ciente de que as células de algumas espécies (rato, por exemplo) pode ser mais frágil do que os outros (rato, por exemplo).
A escolha da colagenase é provavelmente o passo mais importante…
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo alemão National Science Foundation (DFG) e pelo Instituto Federal de Avaliação dos Riscos (BfR, Alemanha).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anesthesia solution | Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun) | Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 μl Rompun (2% Xylazinhydrochlorid) | ||
| Citrate solution | 117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution | |||
| Solution A | 134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Solution A+ | Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Liberase solution | F. Hoffmann‐ La Roche Ltd. | 11988476 001 | 500 μl stock solution in 15 ml solution A (stock solution: 10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.) | |
| Solution B | Content of solution A plus 200 μM CaCl2 and 0.1% DNase solution | |||
| Solution B1/2 | 1:1 mixture of solution A and solution B | |||
| DNase solution | Sigma‐ Aldrich Co. | D4527 | Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris‐HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithioerythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol | |
| Extracellular matrix protein (ECM) solution | Extracellular matrix protein (ECM) solution | E1270 | 1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mL medium M199 | |
| Culture medium M199 | PAA | E15‐834 | Medium M199 supplemented with 1 μl/ml ITS solution and 20 μl/ml penicillin‐streptomycin solution (5000 units/ml) | |
| ITS solution | 25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 μl Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clear solution. Aliquots can be frozen. | |||
| Tyrode | 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Master mix | 5 μl 10×PCR‐Buffer, 5 μl MgCl2 (25 mM), 2 μl forward primer, 2 μl reverse primer, 1 μl dNTP´s (10 mM each), 33 μl H2O, 1 μl DMSO, 1 μl Taq‐DNA polymerase for each sample | |||
| LB‐Medium | 10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0 | |||
| Pac I | New England Biolabs | R0547L | preparation: 50 μg DNA, 5 μl 10×buffer, 0.5 μl 100×BSA, 0.75 μl Pac I, fill with H2O up to final volume of 50μl |
References
- Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, ., Licha, K., Lin, C. P. . Molecular Imaging II. Vol. 7370, 737008-737008 (2009).
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- Kaestner, L., Lipp, P., Shorte, S. L., Frischknecht, F. . Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 289-289 (2007).
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- Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).
