L'isolement et la manipulation génétique des adultes pour les myocytes cardiaques imagerie confocale
Summary
Myocytes cardiaques adultes sont des cellules primaires qui peuvent être isolés de coeurs d'animaux et cultivées pendant plusieurs jours. Durant cette période, la culture de transfert de gènes adénoviraux peut être utilisé pour exprimer les biocapteurs génétiquement codés (ADB) ou des protéines de fusion fluorescentes. Les deux approches permettent d'enquêtes cellulaires par microscopie confocale.
Abstract
Myocytes cardiaques isolés de cœur adulte sont largement acceptés comme un modèle, quelque part à mi-chemin entre les cellules musculaires embryonnaires et néonatales d'un côté et un cœur travaille sur l'autre. Ainsi, les cardiomyocytes servir de bons modèles pour la physiologie cellulaire cardiaque et la physiopathologie, des enquêtes pharmaceutique ainsi que pour l'exploration de modèles animaux transgéniques. Nous décrivons ici une méthode d'isoler les cellules du cœur. En outre, nous montrons comment une manipulation génétique sur les myocytes cardiaques peuvent être effectuées sans l'élevage d'un animal transgénique: C'est la combinaison de la culture à long terme (1 semaine) et le transfert de gènes adénoviraux. Ce dernier est décrit par la construction du virus de la transduction des cellules. Il peut être utilisé pour l'expression de biocapteurs génétiquement codés (ADB), protéines de fusion fluorescentes, mais aussi pour la protéine sur l'expression et la régulation négative, par exemple en utilisant l'ARNi. Ici, nous fournir un exemple pour l'expression d'une protéine de fusion coloration d'une structure subcellulaire (Golgi). L'expression des protéines peuvent être visualisées par l'imagerie confocale de z-piles pour une reconstruction 3D des structures subcellulaires. Le protocole comprend l'état de l'art dans la culture cellulaire, biologie moléculaire et de biophysique et fournit ainsi une méthode pour explorer de nouveaux horizons en cardiologie cellulaire.
Protocol
Discussion
La procédure décrite à l'isolement des cardiomyocytes de rat peut être adapté à d'autres espèces, par exemple la souris 4, si nécessaire. Un paramètre qui doit l'adaptation est le mélange d'enzymes pour la digestion (voir ci-dessous) et aussi la durée de la digestion. Soyez conscient que les cellules de certaines espèces (souris, par exemple) pourrait être plus fragiles que d'autres (chez le rat, par exemple).
Le choix de la collagénase est probab…
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation allemande (DFG) et par l'Institut fédéral pour l'évaluation des risques (BfR, Allemagne).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anesthesia solution | Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun) | Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 μl Rompun (2% Xylazinhydrochlorid) | ||
| Citrate solution | 117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution | |||
| Solution A | 134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Solution A+ | Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Liberase solution | F. Hoffmann‐ La Roche Ltd. | 11988476 001 | 500 μl stock solution in 15 ml solution A (stock solution: 10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.) | |
| Solution B | Content of solution A plus 200 μM CaCl2 and 0.1% DNase solution | |||
| Solution B1/2 | 1:1 mixture of solution A and solution B | |||
| DNase solution | Sigma‐ Aldrich Co. | D4527 | Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris‐HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithioerythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol | |
| Extracellular matrix protein (ECM) solution | Extracellular matrix protein (ECM) solution | E1270 | 1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mL medium M199 | |
| Culture medium M199 | PAA | E15‐834 | Medium M199 supplemented with 1 μl/ml ITS solution and 20 μl/ml penicillin‐streptomycin solution (5000 units/ml) | |
| ITS solution | 25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 μl Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clear solution. Aliquots can be frozen. | |||
| Tyrode | 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Master mix | 5 μl 10×PCR‐Buffer, 5 μl MgCl2 (25 mM), 2 μl forward primer, 2 μl reverse primer, 1 μl dNTP´s (10 mM each), 33 μl H2O, 1 μl DMSO, 1 μl Taq‐DNA polymerase for each sample | |||
| LB‐Medium | 10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0 | |||
| Pac I | New England Biolabs | R0547L | preparation: 50 μg DNA, 5 μl 10×buffer, 0.5 μl 100×BSA, 0.75 μl Pac I, fill with H2O up to final volume of 50μl |
References
- Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, ., Licha, K., Lin, C. P. . Molecular Imaging II. Vol. 7370, 737008-737008 (2009).
- Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).
- Kaestner, L., Lipp, P., Shorte, S. L., Frischknecht, F. . Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 289-289 (2007).
- Kaestner, L., Lipp, P., Popp, J., von Bally, G. . Optics in Life Science. Vol. 6633, 66330K-66330K (2007).
- Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).
