בידוד מניפולציה גנטית של Myocytes לב למבוגרים הדמיה confocal
Summary
Myocytes לב למבוגרים הם תאים ראשוניים, כי יכול להיות מבודד לבבות בעלי חיים מתורבתים במשך כמה ימים. במהלך תקופה זו תרבות העברת גנים adenoviral ניתן להשתמש בהם כדי להביע biosensors מקודדים גנטית (GEBs) או חלבונים היתוך ניאון. שתי הגישות לאפשר חקירות הסלולר באמצעות מיקרוסקופיה confocal.
Abstract
Myocytes לב מבודד בלב מבוגר הן מקובלת כמודל איפשהו באמצע הדרך בין לתאי שריר עובריים בילוד מצד אחד לב עובד על השני. לפיכך, cardiomyocytes לשמש מודלים טוב פיזיולוגיה פתופיזיולוגיה הסלולר לב, לחקירות התרופות, כמו גם למחקר של מודלים של בעלי חיים מהונדס. כאן אנו מתארים שיטה לבודד את התאים מן הלב. יתר על כן אנו מראים כיצד מניפולציה גנטית על myocytes לב יכול להתבצע ללא גידול חיה מהונדס: זהו שילוב של תרבות ארוכת טווח (1 שבוע) ו – העברת גנים adenoviral. האחד האחרון מתואר מהקמת הנגיף התמרה של התאים. זה יכול לשמש לביטוי של biosensors מקודדים גנטית (GEBs), חלבונים היתוך ניאון, אלא גם על ביטוי החלבון על פני מטה הרגולציה, למשל באמצעות RNAi. כאן אנו מספקים דוגמה לביטוי של חלבון היתוך מכתים מבנה subcellular (Golgi). ביטוי חלבון כזה יכול להיות דמיינו ידי הדמיה confocal של Z-ערימות לשיקום-3D של מבנים subcellular. פרוטוקול מורכב המדינה-of-the-art בתרבות התא, ביולוגיה מולקולרית ביופיזיקה ובכך מספק גישה לחקר אופקים חדשים קרדיולוגיה הסלולר.
Protocol
Discussion
ההליך המתואר עבור בידוד של עכברוש cardiomyocytes ניתן להתאים מינים אחרים, כגון עכבר 4, במידת הצורך. פרמטר שצריך הסתגלות היא לערבב אנזים לעיכול (ראה להלן), וכן את משך העיכול. שימו לב כי תאים של כמה מינים (עכבר למשל) עשוי להיות שביר יותר מאחרים (למשל חולדה).
<p class="jove_content" styl…Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הגרמני הקרן הלאומית למדע (DFG) ועל ידי המכון הפדרלי הערכת סיכונים (BFR, גרמניה).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anesthesia solution | Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun) | Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 μl Rompun (2% Xylazinhydrochlorid) | ||
| Citrate solution | 117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution | |||
| Solution A | 134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Solution A+ | Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Liberase solution | F. Hoffmann‐ La Roche Ltd. | 11988476 001 | 500 μl stock solution in 15 ml solution A (stock solution: 10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.) | |
| Solution B | Content of solution A plus 200 μM CaCl2 and 0.1% DNase solution | |||
| Solution B1/2 | 1:1 mixture of solution A and solution B | |||
| DNase solution | Sigma‐ Aldrich Co. | D4527 | Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris‐HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithioerythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol | |
| Extracellular matrix protein (ECM) solution | Extracellular matrix protein (ECM) solution | E1270 | 1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mL medium M199 | |
| Culture medium M199 | PAA | E15‐834 | Medium M199 supplemented with 1 μl/ml ITS solution and 20 μl/ml penicillin‐streptomycin solution (5000 units/ml) | |
| ITS solution | 25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 μl Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clear solution. Aliquots can be frozen. | |||
| Tyrode | 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Master mix | 5 μl 10×PCR‐Buffer, 5 μl MgCl2 (25 mM), 2 μl forward primer, 2 μl reverse primer, 1 μl dNTP´s (10 mM each), 33 μl H2O, 1 μl DMSO, 1 μl Taq‐DNA polymerase for each sample | |||
| LB‐Medium | 10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0 | |||
| Pac I | New England Biolabs | R0547L | preparation: 50 μg DNA, 5 μl 10×buffer, 0.5 μl 100×BSA, 0.75 μl Pac I, fill with H2O up to final volume of 50μl |
References
- Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, ., Licha, K., Lin, C. P. . Molecular Imaging II. Vol. 7370, 737008-737008 (2009).
- Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).
- Kaestner, L., Lipp, P., Shorte, S. L., Frischknecht, F. . Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 289-289 (2007).
- Kaestner, L., Lipp, P., Popp, J., von Bally, G. . Optics in Life Science. Vol. 6633, 66330K-66330K (2007).
- Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).
