L'isolamento e la manipolazione genetica di adulti miociti cardiaci per confocale Imaging
Summary
Adulti miociti cardiaci sono cellule primarie che possono essere isolati da cuori animali e coltivate per diversi giorni. In questo periodo la cultura trasferimento genico adenovirali possono essere usate per esprimere biosensori geneticamente codificato (GEBS) o proteine di fusione fluorescenti. Entrambi gli approcci consentono indagini cellulari mediante microscopia confocale.
Abstract
Miociti cardiaci isolati da cuori adulti sono ampiamente accettate come un modello da qualche parte a metà strada tra le cellule muscolari embrionali e neonatale da un lato e un cuore lavoro, dall'altro. Così, cardiomiociti servire come buoni modelli per cardiache fisiologia e fisiopatologia cellulare, per le indagini farmaceutica e per l'esplorazione di modelli animali transgenici. Qui si descrive un metodo per isolare le cellule del cuore. Inoltre si mostra come una manipolazione genetica su miociti cardiaci possono essere eseguiti senza allevare un animale transgenico: Questa è la combinazione della cultura a lungo termine (1 settimana) e il trasferimento di geni adenovirali. Che quest'ultima sia descritto dalla costruzione del virus per la trasduzione delle cellule. Può essere utilizzato per l'espressione di biosensori geneticamente codificato (GEBS), proteine di fusione fluorescenti, ma anche per le proteine oltre espressione e giù per regolamento, ad esempio utilizzando RNAi. Qui abbiamo un esempio per l'espressione di una proteina di fusione colorazione una struttura subcellulare (Golgi). Espressione di tali proteine possono essere visualizzate da imaging confocale di z-stack per una ricostruzione 3D di strutture subcellulari. Il protocollo comprende state-of-the-art in coltura cellulare, biologia molecolare e di biofisica e fornisce quindi un metodo per esplorare nuovi orizzonti in cardiologia cellulare.
Protocol
Discussion
La procedura descritta per l'isolamento dei cardiomiociti di ratto può essere adattato ad altre specie, ad esempio, il mouse 4, se necessario. Un parametro che ha bisogno di adattamento è il mix di enzimi per la digestione (vedi sotto) e anche la durata della digestione. Essere consapevoli del fatto che le cellule di alcune specie (topo per esempio) potrebbe essere più fragile di altri (ad esempio, ratto).
La scelta di collagenasi è probabilmente il passo più importante n…
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation tedesco (DFG) e dall'Istituto federale per la valutazione dei rischi (BfR, Germania).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anesthesia solution | Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun) | Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 μl Rompun (2% Xylazinhydrochlorid) | ||
| Citrate solution | 117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution | |||
| Solution A | 134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Solution A+ | Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Liberase solution | F. Hoffmann‐ La Roche Ltd. | 11988476 001 | 500 μl stock solution in 15 ml solution A (stock solution: 10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.) | |
| Solution B | Content of solution A plus 200 μM CaCl2 and 0.1% DNase solution | |||
| Solution B1/2 | 1:1 mixture of solution A and solution B | |||
| DNase solution | Sigma‐ Aldrich Co. | D4527 | Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris‐HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithioerythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol | |
| Extracellular matrix protein (ECM) solution | Extracellular matrix protein (ECM) solution | E1270 | 1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mL medium M199 | |
| Culture medium M199 | PAA | E15‐834 | Medium M199 supplemented with 1 μl/ml ITS solution and 20 μl/ml penicillin‐streptomycin solution (5000 units/ml) | |
| ITS solution | 25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 μl Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clear solution. Aliquots can be frozen. | |||
| Tyrode | 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Master mix | 5 μl 10×PCR‐Buffer, 5 μl MgCl2 (25 mM), 2 μl forward primer, 2 μl reverse primer, 1 μl dNTP´s (10 mM each), 33 μl H2O, 1 μl DMSO, 1 μl Taq‐DNA polymerase for each sample | |||
| LB‐Medium | 10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0 | |||
| Pac I | New England Biolabs | R0547L | preparation: 50 μg DNA, 5 μl 10×buffer, 0.5 μl 100×BSA, 0.75 μl Pac I, fill with H2O up to final volume of 50μl |
References
- Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, ., Licha, K., Lin, C. P. . Molecular Imaging II. Vol. 7370, 737008-737008 (2009).
- Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).
- Kaestner, L., Lipp, P., Shorte, S. L., Frischknecht, F. . Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 289-289 (2007).
- Kaestner, L., Lipp, P., Popp, J., von Bally, G. . Optics in Life Science. Vol. 6633, 66330K-66330K (2007).
- Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).
