El aislamiento y la manipulación genética de los miocitos cardiacos adultos de microscopía confocal
Summary
Adultos miocitos cardíacos son las células primarias que pueden ser aisladas de corazones de animales y se cultivan durante varios días. Dentro de este período de la cultura de transferencia génica adenoviral pueden ser utilizadas para expresar biosensores genéticamente codificados (GEBS) o proteínas fluorescentes de fusión. Ambos enfoques permiten investigaciones celulares por medio de microscopía confocal.
Abstract
Miocitos cardíacos aislados de corazones de adultos son ampliamente aceptados como un modelo en algún lugar a medio camino entre las células musculares embrionarias y neonatal en un lado y un corazón de trabajo por el otro. Por lo tanto, los cardiomiocitos servir como buenos modelos para la fisiología y la fisiopatología celular cardiaca, para la investigación farmacéutica, así como para la exploración de modelos de animales transgénicos. A continuación se describe un método para aislar las células del corazón. Además se muestra como una manipulación genética en los miocitos cardíacos se pueden realizar sin la cría de un animal transgénico: Esta es la combinación de la cultura a largo plazo (1 semana) y la transferencia de genes adenovirales. Este último es descrito por la construcción de los virus de la transducción de las células. Puede ser utilizado para la expresión de los biosensores genéticamente codificados (GEBS), las proteínas fluorescentes de fusión, sino también para las proteínas sobre la expresión y regulación a la baja, por ejemplo, utilizando RNAi. Aquí tenemos un ejemplo de la expresión de una proteína de fusión de tinción de una estructura subcelular (Golgi). Como expresión de la proteína puede ser visualizado por la imagen confocal de z-pilas para una reconstrucción en 3D de estructuras subcelulares. El protocolo comprende el estado de la técnica en el cultivo celular, biología molecular y biofísica, y por lo tanto proporciona un método para explorar nuevos horizontes en cardiología celular.
Protocol
Discussion
El procedimiento descrito para el aislamiento de los cardiomiocitos de rata se puede adaptar a otras especies, por ejemplo, 4 de ratón, si es necesario. Un parámetro que las necesidades de adaptación es la mezcla de enzimas para la digestión (ver abajo) y también la duración de la digestión. Tenga en cuenta que las células de algunas especies (por ejemplo, ratón) puede ser más frágiles que otros (por ejemplo, ratas).
La elección de la colagenasa es probablemente el pas…
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias alemana (DFG) y el Instituto Federal de Evaluación de Riesgos (BfR, Alemania).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Anesthesia solution | Serumwerk Bernburg GmbH (Ursotamin), Bayer Health Care (Rompun) | Mixture of 1 ml Ursotamin (100 mg/ml Ketaminhydrochlorid) and 240 μl Rompun (2% Xylazinhydrochlorid) | ||
| Citrate solution | 117,64 mg sodium citrate in 10 ml 0.9% NaCl solution | |||
| Solution A | 134 mM NaCl, 4 mM KCl, 11 mM glucose, 1.2 mM MgSO4, 1.2 mM Na2HPO4, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Solution A+ | Content of solution A plus 0.2 mM EGTA, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Liberase solution | F. Hoffmann‐ La Roche Ltd. | 11988476 001 | 500 μl stock solution in 15 ml solution A (stock solution: 10 mg/ml Liberase Blendzyme 4 in aqua dest.) | |
| Solution B | Content of solution A plus 200 μM CaCl2 and 0.1% DNase solution | |||
| Solution B1/2 | 1:1 mixture of solution A and solution B | |||
| DNase solution | Sigma‐ Aldrich Co. | D4527 | Deoxyribonuclease I, Type 2 from bovine pancreas, 40 KU (15 mg) are dissolved in 5 ml of 10 mM Tris‐HCl buffer, adjusted to pH=7.35, additional content: 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithioerythritol; this solution is mixed with 5 ml glycerol | |
| Extracellular matrix protein (ECM) solution | Extracellular matrix protein (ECM) solution | E1270 | 1 ml stock solution as purchased is diluted with 6 mL medium M199 | |
| Culture medium M199 | PAA | E15‐834 | Medium M199 supplemented with 1 μl/ml ITS solution and 20 μl/ml penicillin‐streptomycin solution (5000 units/ml) | |
| ITS solution | 25 mg Insulin, 25 mg Transferrin and 50 μl Selenite stock solution are dissolved in 5 ml aqua dest. (stock solution: 0.5 mg/ml Sodiumselenite in aqua dest.). Add a few drops of 1 M HCl until one should get a clear solution. Aliquots can be frozen. | |||
| Tyrode | 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 2mM MgCl2, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH adjusted to 7.35 using 10 M NaOH, sterile filtered | |||
| Master mix | 5 μl 10×PCR‐Buffer, 5 μl MgCl2 (25 mM), 2 μl forward primer, 2 μl reverse primer, 1 μl dNTP´s (10 mM each), 33 μl H2O, 1 μl DMSO, 1 μl Taq‐DNA polymerase for each sample | |||
| LB‐Medium | 10 g/l Tryptone, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (and 15 g/l Agar if used as solid medium), pH 7.0 | |||
| Pac I | New England Biolabs | R0547L | preparation: 50 μg DNA, 5 μl 10×buffer, 0.5 μl 100×BSA, 0.75 μl Pac I, fill with H2O up to final volume of 50μl |
References
- Kaestner, L., Ruppenthal, S., S, ., Licha, K., Lin, C. P. . Molecular Imaging II. Vol. 7370, 737008-737008 (2009).
- Viero, C., Kraushaar, U., Ruppenthal, S. In vivo imaging of Drosophila melanogaster pupae with mesoscopic fluorescence tomography. Cell Calcium. 43 (1), 59-59 (2008).
- Kaestner, L., Lipp, P., Shorte, S. L., Frischknecht, F. . Imaging Cellular and Molecular Biological Functions. , 289-289 (2007).
- Kaestner, L., Lipp, P., Popp, J., von Bally, G. . Optics in Life Science. Vol. 6633, 66330K-66330K (2007).
- Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol Biol. 515, 107-107 (2009).
