重新用四个转录因子的小鼠胚胎成纤维细胞诱导多能干细胞的产生，强力霉素诱导慢病毒转导系统

Summary

Stemgent阿霉素诱导小鼠TF慢病毒设置可以重新编程诱导多能干细胞（iPS细胞）的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。在这里，我们展示了鼠标重新编程转录因素Oct4的DOX诱导表达的协议，SOX2，KLF4和c – Myc基因产生的iPS殖民地，表达共同的MES多能性标志物。

Abstract

Yamanaka和他的同事使用的转录因子和细胞培养条件的定义设置，表明逆转录病毒介导的传递和表达Oct4的，SOX2，c – Myc基因和Klf4是能够诱导小鼠成纤维细胞^的全能性。1随后的报告已经证实的效用强力霉素（DOX）诱导慢病毒传送系统从各种其他成年鼠的体细胞类型的小学和中学的iPS细胞^的生成。2,3

诱导多能干细胞（iPS）细胞类似胚胎干（ES）细胞形态，增殖和诱导形成畸胎瘤的能力。两种类型的细胞可作为多能干开始产生分化的细胞或组织再生医学材料^。4-6 iPS细胞也有一个明显的优势超过ES细胞，他们表现出ES细胞的关键特性，没有道德的两难破坏胚胎。

在这里，我们展示了重新Stemgent阿霉素诱导小鼠TF慢病毒设置的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的协议。我们也证明Stemgent阿霉素诱导小鼠TF慢病毒设置能够表达到MEFs后转四个转录因子，从而诱导多能干细胞状态，显示的ES细胞的特性全能性标志物。

Protocol

<p class="jove_title"> 1。病毒转导的MEFs</p><ol><li前一天开始你的实验，大衣15厘米的细胞，用0.2％的明胶无菌培养皿中DDH过滤₂ O。过夜孵育盘，在37 ° C和5％的CO₂。</li><li>明胶涂层盘，种子MEF细胞（我们使用Nanog-GFP/rtTA MEF细胞）在4 ×密度液体吸⁵每皿细胞。孵育细胞30毫升MEF生长培养基（450毫升的DMEM与50毫升胎牛血清，5毫升100X非必需氨基酸，5 ml青霉素/链霉素，5毫升200毫米L -谷氨酰胺和0.5毫升55MMβ-巯基乙醇补充）这两天在37 ° C和5％的CO₂直到大约80％汇合。</li><li>吸中期和MEF的增长与集中的慢病毒（4 × 100μL病毒原液+增长29.6毫升培养基）培养基中添加30毫升。轻轻晃动的菜，以确保中期的均匀分布。孵育细胞过夜在37 ° C和5％的CO₂。</li></ol><p class="jove_title"> 2。强力霉素诱导的重编程</p><ol><li> 20-24小时后转导，细胞trypsinize，在5分钟的200 XG离心机和ES / IPS生长介质悬浮（450毫升淘汰赛的DMEM50毫升ES细胞合格的小牛血清，5 ml青霉素/链霉素补充， 5毫升200毫米L -谷氨酰胺，0.5毫升β-巯基乙醇和25μLLIF）。种子转导的细胞培养皿大小适当集中MEF的（我们用2.5 × 10<sup> 5</sup每10厘米的盘，重新编程的效率实验和殖民地隔离和2>细胞<sup> 4</sup国际刑事法院的实验在4孔板，每孔细胞）。在37> 2</sub>。注：任何剩余的细胞可以液态氮冷冻，供日后分析。</li><li>吸液和替换ES / IPS中等准备补充新鲜和强力霉素的终浓度为2微克/毫升（我们还添加了没有DOX的培养基作为阴性对照）。孵育37 ° C和5％的CO₂。</li></ol><p class="jove_title"> 3。免疫组织化学分析转染效率</p><p class="jove_content"> 48小时后，强力霉素诱导，确定采用免疫组织化学（ICC）的转导效率。 4孔板replated的细胞上，开展国际刑事法院的测试。根据细胞培养板的大小，应调整以下协议中列出的所有卷。</p><ol><li>轻轻的细胞用PBS清洗一次（无镁<sup> 2 +</sup+或Ca^{2 +}）。</li><li>修复细胞，用500μL0.5毫升4％多聚甲醛的PBS在室温下15分钟。</li><li>洗细胞轻轻两次用PBS。</li><li>通透细胞，加入500μL冰冷的0.2％吐温® -20的PBS。孵育10分钟，在室温。</li><li>洗细胞轻轻两次用PBS。</li><li>座200μL阻断缓冲液在室温下1小时的非特异性结合。</li><li> 200μL的特定抗体的细胞在4℃过夜孵育° C（我们用Oct4的，SOX2，KLF4和c – Myc）。</li><li>洗细胞轻轻两次用PBS。</li><li> 200μL二次抗体培养的细胞在室温下1小时，保护光板（我们用驴抗兔若丹明共轭，驴抗山羊AlexaFluor ® 594驴抗小鼠若丹明共轭轭，和驴抗兔若丹明共轭）。</li><li>洗细胞轻轻两次用PBS。</li><li>添加的DAPI（终浓度为2微克/毫升的PBS），孵育10分钟可视化核。</li><li>轻轻地用PBS清洗细胞。</li><li>前加入防褪色AQUA式成像使用倒置荧光显微镜。</li></ol><p class="jove_title"> 4。 IPS细胞集落的分离和扩大</p><ol><li（第2条所述）>重编程过程启动后，监测的文化和取代中期每48小时。我们的第一个12天的使用强力霉素培养基培养细胞，并随后从中期的强力霉素，以确保该IPS殖民地手动扩张回升将DOX的独立。</li><li>细胞应每天监测为重编程过程的指标的形态学变化;或使用Nanog-GFP/rtTA MEF细胞，监察形态和GFP荧光，以确定重新编程的殖民地。每个实验会有所不同，但殖民地足够大，一般为16至22天的隔离。在这段时间内确定的殖民地，然后可以手动分离和胰酶消化扩张和分析。</li><li>隔离和trypsinizing重新编程殖民地之前的一天，准备与γ-辐照饲养层MEFs播种密度5 × 10的24孔板⁴每口井的细胞。在37 ° C和5％的二氧化碳孵育过夜₂。</li><li>手动挑选每个IPS的殖民地和trypsinize游离细胞聚集。重制版的ES / IPS与γ射线辐照饲养层MEFs前接种在24孔板单井中等iPS细胞。井应接种密度为2 × 10⁵细胞/孔。孵育37 ° C和5％的CO₂。每24小时更换媒体。</li><li>每天增长和绿色荧光显示器的iPS殖民地。我们孵育前6天传代我们的文化。</li><li>确定的24孔板的孔均匀表达GFP。具有良好的GFP表达式的水井可胰酶消化和已经与伽马射线辐照接驳层MEFs前播种为4好盘子传1:8。 ICC和AP染色，这些板块可以用于多能干标记分析。</li></ol><p class="jove_title"> 5。为多能性的免疫组织化学分析</p><p class="jove_content"我们的国际刑事法院的测试进行了4孔板扩大细胞。根据细胞培养板的大小，应调整以下协议中列出的所有卷。</p><ol><li>轻轻地用PBS清洗细胞两次（无镁<sup> 2 +</sup+或Ca^{2 +}）。</li><li在冰冷的0.2％吐温20的PBS，每孔10分钟0.5毫升孵育。</li><li>清洗细胞，用PBS轻轻三次。</li><li>座200μL阻断缓冲液在室温下1小时的非特异性结合。</li><li> 200μL的特定抗体的细胞在4℃过夜孵育° C（使用SSEA – 1，Nanog和Oct4的）。</li><li>洗细胞轻轻两次用PBS。</li><li> 200μL二次抗体培养的细胞在室温下1小时，保持光（我们用驴抗小鼠若丹明共轭和驴抗兔若丹明共轭）。</li><li>洗细胞轻轻两次用PBS。</li><li>添加的DAPI（终浓度为2微克/毫升的PBS），孵育10分钟可视化核。</li><li>轻轻地用PBS清洗细胞</li><li>前加入防褪色AQUA式成像使用倒置荧光显微镜。</li></ol><p class="jove_title"> 6。碱性磷酸酶（AP）染色的iPS细胞集落</p><ol><li> IPS从第4殖民地，也可以分析美联社活动利用市售试剂盒，并按照制造商的协议。</li></ol><p class="jove_title">第7部分。代表性的成果</p><p class="jove_content"> Stemgent阿霉素诱导小鼠TF慢病毒设置可用于iPS细胞重新编程MEFs。转导的MEFs，转录因素Oct4的表达后，SOX2的，KLF4和c – Myc基因可以被用强力霉素治疗的细胞中检测到（阿霉素+），但很少或根本没有表达可以被检测到未经处理的（DOX -）细胞（图1） 。随着时间的推移，在这个例子中的阿霉素治疗（12天），以产生更大，更ES定义的菌落边缘和三维增长（图2a）细胞样菌落形态变化会进步。当DOX被删除，有一个明显的细胞形态回归的一些胚胎干细胞样的殖民地，但是，许多殖民地保持他们的IPS形态（图2a）。这些IPS菌落，挑传代时，显示碱性磷酸酶（AP），Nanog的Oct4和SSEA – 1（图3）典型的多能性标志物表达。 MEF细胞的重新编程，以全能性状态时，从内源性Nanog的轨迹，在这个实验中（Nanog-GFP/rtTA MEF细胞）表达绿色荧光蛋白的类型。 GFP的表达，因此可以被用来作为一个成功的重新编程（图3）的初步指标。</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig1.jpg" alt="Figure 1" >图1：</strong>免疫细胞化学（ICC）的分析，48小时后阿霉素诱导。最左边的面板（DOX）的是有代表性的四个传导因子的表达没有阿霉素诱导的阴性对照。正确表达的转录因子被证实DAPI染色，以可视化的细胞核，由相应的抗体（红色显示）。</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig2.jpg" alt="Figure 2" >图2：</strong> Nanog-GFP/rtTA MEFs iPS细胞状态的形态转换。一）100X阶段展示压实和MEFs转换成的iPS殖民地的时间从3天（D3 + DOX）第22天（D22）的细胞的相衬成像。 DOX的是12天撤回。左上面板：20倍阴性对照的图像从DOX的板块。二）200X相衬和GFP荧光图像突出一天18后的阿霉素诱导的iPS殖民地。三）200X相衬和GFP荧光图像，增加一天18后的阿霉素诱导的iPS殖民地。</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig3.jpg" alt="Figure 3" >图3：</strong>分析的iPS殖民地。 （一）相差显微镜和AP染色的IPS殖民地（200X）。 （二）多能性标志物分析：左侧面板显示阶段与绿色荧光蛋白重新编程记者表达的对比覆盖。 GFP的表达，反映内源性的Nanog的表达水平。中间面板显示国际刑事法院的多能性标志物的染色。右侧的面板显示DAPI染色，以形象化的原子核（100X）。</p>

Discussion

这些结果表明，Stemgent阿霉素诱导小鼠TF慢病毒设置，可以用来有效地生成的iPS诱导异位表达的殖民地转导的转录因子在小鼠胚胎成纤维细胞。设计重新编程实验时，应考虑几个变量，重新编程，以优化效率。首先，它是可以修改的活跃病毒对靶细胞的比例（即MOI），在原发感染的步骤来增加或减少转染效率，进而影响到综合病毒的靶细胞人口数量。二，调整的时间长短可以影响细胞暴露在DOX的IPS细胞集落生成效率。第三，靶细胞的增殖能力的影响重新编程，作为正在积极生长和分裂的细胞更适合重新编程。最后，修改为不同的手机号码或不同大小的组织培养皿的协议时，建议按比例调整到培养皿的表面区域，目标手机号码。

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
DOX Inducible Mouse TF Concentrated Lentifirus Set		Stemgent	00-0003