Generering av inducerade pluripotenta stamceller genom att programmera om musen Embryonala fibroblasts med en fyra transkriptionsfaktor, Doxycyklin inducerbara Lentiviral Transduction System

Summary

Den Stemgent Dox inducerbara mus TF lentivirus Set kan programmera om musen embryonala fibroblaster (MEFs) till inducerad (IPS) pluripotenta stamceller. Här kan vi visa protokollet för DOX-inducerbara uttryck för musen omprogrammering transkriptionsfaktorer Oct4 till Sox2, Klf4 och c-Myc skapa iPS kolonier som uttrycker gemensamma MES pluripotens markörer.

Abstract

Med hjälp av en definierad uppsättning transkriptionsfaktorer och cell villkor kultur, Yamanaka och kollegor visade att retrovirus-medierad leverans och uttryck Oct4, Sox2, c-Myc och Klf4 kan förmå pluripotens på musfibroblaster. ¹ Påföljande rapporter har visat på nyttan av doxycyklin (DOX) inducerbara Lentiviral leverans system för generering av både primära och sekundära iPS-celler från en mängd andra somatiska vuxen mus celltyper. ^2,3

Inducerade pluripotenta stamceller (IPS) celler liknar embryonala stamceller (ES-celler) i morfologi, spridning och förmåga att inducera teratom bildas. Båda typerna av celler kan användas som pluripotenta utgångsmaterial för produktion av differentierade celler eller vävnader i regenerativ medicin. ^4-6 iPS-celler har också en klar fördel framför ES-celler som de uppvisar viktiga egenskaper hos ES-celler utan det etiska dilemmat embryot förstörs.

Här kan vi visa protokollet för omprogrammering möss embryonala fibroblaster (MEF) celler med Stemgent DOX inducerbara mus TF lentivirus Set. Vi visar också att Stemgent DOX inducerbara mus TF lentivirus Set är i stånd att uttrycka de fyra transkriptionsfaktorer vid transduktion i MEFs därmed inducera en pluripotenta tillstånd stamceller som visar pluripotens markörer egenskap hos ES-celler.

Protocol

<p class="jove_title"> 1. Viral Transduction av MEFs</p><ol><li> Dagen innan experimentet, päls en 15 cm cellkultur skålen med 0,2% gelatin steril filtreras i DDH₂ O. Inkubera plattan över natten vid 37 ° C och 5% CO₂.</li><li> Aspirera vätskan från gelatin belagda skålen, och utsäde celler MEF (vi använde Nanog-GFP/rtTA MEF celler) vid en densitet av 4×10⁵ Celler per maträtt. Inkubera cellerna i 30 ml MEF tillväxt medium (450 ml DMEM kompletteras med 50 ml FBS, 5 ml 100x icke-essentiella aminosyror, 5 ml penicillin / streptomycin, 5 ml 200 mM L-glutamin och 0,5 ml 55mm β-merkaptoetanol) för två dagar vid 37 ° C och 5% CO₂ Tills ca 80% konfluenta.</li><li> Sug på medellång och tillsätt 30 ml MEF odlingsmedium kompletteras med koncentrerad lentivirus (4 x 100 l virus stamlösning + 29,6 ml odlingsmedium). Rock skålen försiktigt för att säkerställa en jämn fördelning av mediet. Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C och 5% CO₂.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Doxycyklin Inducerad Omprogrammering</p><ol><li> 20-24 timmar efter transduktion, trypsinize den transduced celler, centrifugera vid 200 xg under 5 minuter och återsuspendera i ES / IPS odlingsmedium (450 ml Knockout DMEM kompletteras med 50ml ES-celler kvalificerade kalvserum, 5 ml penicillin / streptomycin, 5 ml 200 mM L-glutamin, 0,5 ml β-merkaptoetanol och 25 l LIF). Seed transduced MEF är vid en lämplig koncentration för cellodling maträtt storlek (vi använde 2,5 x 10⁵ Celler per 10 cm parabolantenn för omprogrammering effektivitet experiment och koloni isolering, och 2 x 10⁴ Celler per väl i 4 brunnar för ICC experiment). Inkubera över natten vid 37 ° C och 5% CO₂. Obs: eventuella kvarvarande transduced celler kan frysas i flytande kväve för framtida analys.</li><li> Sug på medellång och ersätt med ES / IPS medelstora beredas på nytt och kompletteras med doxycyklin till en slutlig koncentration på 2 mikrogram / ml (vi också lagt medium utan DOX som negativ kontroll). Inkubera vid 37 ° C och 5% CO₂.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Immuncytokemiska Analys av Transduction Effektivitet</p><p class="jove_content"> 48 timmar efter doxycyklin induktion, bestämma transduktion effektivitet genom immunohistokemi (ICC). Utför ICC tester på celler replated i 4 bra tallrikar. Alla volymer visas i följande protokoll bör justeras i enlighet med cellodling plattan storlek.</p><ol><li> Tvätta cellerna försiktigt en gång med PBS (utan Mg^{2 +} + Eller Ca^{2 +}).</li><li> Fixera cellerna med 500 l på 0,5 ml 4% paraformaldehyd i PBS i 15 minuter i rumstemperatur.</li><li> Tvätta cellerna försiktigt två gånger med PBS.</li><li> Permeabilize celler genom att tillsätta 500 l av iskall 0,2% Tween ® -20 i PBS. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.</li><li> Tvätta cellerna försiktigt två gånger med PBS.</li><li> Blockera icke-specifik bindning med 200 l blockerande buffert i en timme vid rumstemperatur.</li><li> Inkubera cellerna med 200 l av de specifika primära antikroppen över natten vid 4 ° C (vi använde Oct4, Klf4, Sox2 och c-Myc).</li><li> Tvätta cellerna försiktigt två gånger med PBS.</li><li> Inkubera cellerna med 200 l av sekundära antikroppar i 1 timme i rumstemperatur och skyddar plattorna från ljus (vi använde Donkey anti-kanin Rhodamine konjugatet, Donkey anti-get AlexaFluor ® 594 konjugat, Donkey anti-mus Rhodamine konjugat och Donkey anti -Kanin Rhodamine konjugat).</li><li> Tvätta cellerna försiktigt två gånger med PBS.</li><li> Lägg DAPI (slutlig koncentration 2 mikrogram / ml i PBS) och inkubera 10 minuter för att visualisera kärnor.</li><li> Tvätta cellerna försiktigt med PBS.</li><li> Lägg till anti-fade Aqua-Mount innan avbildning med ett inverterat fluorescerande mikroskop.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Isolera och expandera iPS cell Kolonierna</p><ol><li> Efter inledande omprogrammeringen processen (som beskrivs i avsnitt 2), övervaka kulturer och byt medelstora varje 48 timmar. Vi använde doxycyklin innehåller medium till kulturen cellerna för de första tolv dagar och sedan därefter bort doxycyklin från mediet för att säkerställa att iPS kolonierna manuellt plockas för expansion skulle vara DOX oberoende.</li><li> Celler bör kontrolleras dagligen för morfologiska förändringar som tyder på omprogrammeringen processen, eller vid användning av celler som Nanog-GFP/rtTA MEF, övervaka morfologi och GFP fluorescens för att identifiera omprogrammeras kolonier. Varje experiment kommer att vara annorlunda, men kolonierna i allmänhet är stora nog för isolering mellan 16 och 22 dagar. Kolonier som identifierats under denna tidsram kan sedan manuellt isoleras och trypsinized för expansion och analys.</li><li> Dagen innan isolera och trypsinizing den omprogrammeras kolonierna, förbereda en 24-brunnar genom att seeda med gamma-bestrålade feeder layer MEFs vid en densitet av 5 x 10⁴ Celler per brunn. Inkubera över natten vid 37 ° C och 5% CO₂.</li><li> Manuellt plocka varje iPS koloni och trypsinize att skilja cellaggregat. Re-platta på iPS-celler i ES / IPS medium i enskilda brunnar av 24-brunnar före ympats med gamma-bestrålade feeder layer MEFs. Brunnar bör vara seedade vid en densitet av 2 x 10⁵ Celler / brunn. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO₂. Ändra media varje 24 timmar.</li><li> Övervaka iPS kolonier dagligen för tillväxt och GFP fluorescens. Vi inkubera våra kulturer i 6 dagar innan passaging.</li><li> Bestäm vilka brunnar av 24-brunnar jämnt uttrycker GFP. Brunnar som har bra GFP uttryck kan trypsinized och passerats 01:08 till 4-brunnars plattor som har pre-ympats med gamma-bestrålade feeder layer MEFs. Dessa skyltar kan användas för pluripotenta markör analys av ICC och AP färgning.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Immuncytokemiska Analys för pluripotens</p><p class="jove_content"> Vår ICC-testningen har utförts på celler expanderat i 4 bra tallrikar. Alla volymer visas i följande protokoll bör justeras i enlighet med cellodling plattan storlek.</p><ol><li> Tvätta cellerna försiktigt två gånger med PBS (utan Mg^{2 +} + Eller Ca^{2 +}).</li><li> Inkubera i 0,5 ml iskall 0,2% Tween 20 i PBS per brunn i 10 minuter.</li><li> Tvätta cellerna försiktigt tre gånger med PBS.</li><li> Blockera icke-specifik bindning med 200 l blockerande buffert i en timme vid rumstemperatur.</li><li> Inkubera cellerna med 200 l av de specifika primära antikroppen över natten vid 4 ° C (vi använde SSEA-1, NANOG och Oct4).</li><li> Tvätta cellerna försiktigt två gånger med PBS.</li><li> Inkubera cellerna med 200 l av sekundära antikroppar i 1 timme i rumstemperatur, hålla borta från ljus (vi använde Donkey anti-mus Rhodamine konjugat och Donkey anti-kanin Rhodamine konjugat).</li><li> Tvätta cellerna försiktigt två gånger med PBS.</li><li> Lägg DAPI (slutlig koncentration 2 mikrogram / ml i PBS) och inkubera 10 minuter för att visualisera kärnor.</li><li> Tvätta cellerna försiktigt med PBS</li><li> Lägg till anti-fade Aqua-Mount innan avbildning med ett inverterat fluorescerande mikroskop.</li></ol><p class="jove_title"> 6. Alkaliskt fosfatas (AP) Infärgning av iPS cell Kolonier</p><ol><li> IPS kolonier från avsnitt 4 kan också analyseras för AP aktivitet utnyttja kommersiellt tillgänglig kit och enligt tillverkarens protokollet.</li></ol><p class="jove_title"> Del 7. Representativa resultat</p><p class="jove_content"> Den Stemgent DOX inducerbara mus TF lentivirus set kan användas för att programmera MEFs till iPS-celler. Efter transduktion av MEFs, uttrycket av transkriptionsfaktorer Oct4 kan Sox2, Klf4 och c-Myc detekteras i celler som behandlats med doxycyklin kan (DOX +), men lite eller inget uttryck spåras i obehandlade (DOX-) celler (figur 1) . Morfologiska förändringar kommer att utvecklas över tid (12 dagar DOX behandling i detta exempel) för att skapa större, mer ES cell-liknande kolonier med definierade koloni kanter och tredimensionell tillväxt (figur 2a). När DOX tas bort, det finns en märkbar återgång av cellulär morfologi för några ES-celler-liknande kolonier har dock behållit många av kolonierna deras iPS morfologi (figur 2a). Dessa iPS kolonier, då plockas och passerats, visa typiska pluripotens markör uttryck för alkaliskt fosfatas (AP), NANOG, Oct4 och SSEA-1 (figur 3). Den typ av MEF celler som används i detta experiment (Nanog-GFP/rtTA MEF celler) uttrycka GFP från endogena NANOG lokus när omprogrammeras till pluripotens staten. GFP uttryck kan därför användas som en preliminär indikator för framgångsrik omprogrammering (figur 3).</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig1.jpg" alt="Figure 1" > Figur 1:</strong> Immuncytokemi (ICC) analys 48 timmar efter DOX induktion. Längst till vänster panel (-DOX) är en representativ negativ kontroll för uttryck av de fyra transduktion faktorer utan DOX induktion. Korrekt uttryckt transkriptionsfaktorer bekräftades av motsvarande antikroppar (visas i rött), färgade med DAPI att visualisera kärnan.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig2.jpg" alt="Figure 2" > Figur 2:</strong> Morfologiska konvertering av Nanog-GFP/rtTA MEFs till iPS-celler staten. A) 100x faskontrast avbildning av celler som visar packning och konvertering av MEFs till iPS kolonier över tid från dag 3 (D3 + Dox) till dag 22 (D22). DOX drogs tillbaka på dag 12. Övre vänstra panelen: 20x negativa kontrollen bild från-DOX platta. B) 200x faskontrast och GFP fluorescens bilder av markerad dag 18 post-DOX induktion iPS koloni. C) 200x faskontrast och GFP fluorescens bilder av ytterligare dag 18 post-DOX induktion iPS koloni.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/1447/1447fig3.jpg" alt="Figure 3" > Figur 3:</strong> Analys av IPS kolonier. (A) Fas kontrast mikroskopi och AP färgning av en iPS koloni (200x). (B) pluripotens markör analys: Vänster panel visar overlay faskontrast med GFP omprogrammering reporter uttryck. GFP uttryck speglar den endogena NANOG uttrycket nivå. Mellan panelen visar ICC färgning för pluripotens markörer. Rätt panelen visar DAPI färgning för att visualisera kärnor (100x).</p>

Discussion

Dessa resultat visar att Stemgent DOX inducerbara mus TF lentivirus set kan användas för att effektivt skapa iPS kolonierna genom att inducera den ektopisk uttryck för transduced transkriptionsfaktorer i mus embryonala fibroblaster. Vid utformningen av omprogrammering experiment bör flera variabler anses optimera effektiviteten i programplaneringen. Först är det möjligt att ändra den aktiva virus till målcellen ratio (dvs MOI) under primär infektion steg för att öka eller minska transduktion effektivitet, vilket påverkar antalet integrerade virus i målcellpopulationen. För det andra kan justera hur länge de celler utsätts för DOX påverka effektiviteten i iPS-celler koloni generation. Tredje kan proliferativ kapacitet målceller påverkan omprogrammering, som celler som aktivt växer och dividera är mer mottagliga för omprogrammering. Slutligen, när du ändrar protokollet för olika cell nummer eller olika storlek vävnad rätter kultur, rekommenderas att målcellen siffror justeras i proportion till ytan av kulturen skålen.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
DOX Inducible Mouse TF Concentrated Lentifirus Set		Stemgent	00-0003