Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
תיאור של הליך זירחון כמותי באמצעות cryolysis, solubilziation אוריאה, חלוקה HILIC והעשרה iMac של פפטידים פוספורילציה.
Abstract
פרוטוקול זה מתאר את הצמיחה גירוי, עם oleate חומצת שומן, כבד isotopically ואור תאים ס cerevisiae. תאים הם הקרקע באמצעות הליך cryolysis במטחנת כדור הטחנה ואת grindate וכתוצאה מכך הביא לתוך פתרון על ידי solubilization אוריאה. הליך זה מאפשר תמוגה של התאים במצב פעיל מטבולית, שימור זירחון ומניעת ארגון מחדש של phosphoproteome במהלך תמוגה התא. בעקבות הירידה, אלקילציה, עיכול טריפסין של החלבונים, הן דגימות desalted על עמודות C18 ואת המורכבות מדגם מופחת על ידי חלוקה באמצעות כרומטוגרפיה אינטראקציה הידרופילי (HILIC). עמודות HILIC מעדיפים לשמור על מולקולות הידרופיליות אשר הוא גם מתאים phosphoproteomics. פפטידים phosphorylated נוטים elute בהמשך הפרופיל chromatographic מאשר עמיתיהם הלא פוספורילציה. לאחר חלוקה, phosphopeptides מועשרים באמצעות כרומטוגרפיה מתכת משותקת, אשר מסתמכת על תשלום מבוסס זיקות להעשרת phosphopeptide. בתום הליך זה דגימות מוכנים להיות מנותח על ידי ספקטרומטריית מסה כמותית.
Protocol
Discussion
שיטה זו תניב העשרה של phosphopeptides כי ניתן לנתח באופן כמותי. מספר פרמטרים ניתן לשנות בפרוטוקול זה, אבל ההיבט החשוב ביותר שיש לזכור הוא לשמר זירחון שלך. הכנת תאים כימות ניתן להשיג במספר דרכים שונות, למשל אם אתה לא יכול תווית התאים שלך, תגי vivo כגון ICAT [3] או ITRAC [4] יכול …
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד"ר עשיר רוג'רס לקבלת סיוע טכני עם מנתח ספקטרומטריית מסה ודיונים מועיל, בני הזוג. רוב מוריץ, ג'ף Ranish ו חמיד Mirzai לדיונים מועילים.
עבודה זו מומנה על ידי המרכז הלאומי לבריאות של אקסלנס.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 | Sigma-Aldrich | 608033 | ||
| Isotec™ L-Lysine-15N2 | Sigma-Aldrich | 609021 | ||
| GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid | Invitrogen | 70011044 | ||
| SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | ||
| Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420 | ||
| Retsch PM100 Ball Mill Grinder | Retsch | 20.540.0001 | ||
| Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar | Retsch | 01.462.0148 | ||
| Ultramicrospin C18 column | The Nest Group | SUM SS10 | ||
| Sep-Pak Vac 500 mg C18 | Waters | WAT043395 | ||
| TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column | TOSOH BioSciences | 13071 | This is the HILIC chromatographic column. | |
| Guard column 4.6 mm ID x1 cm | TOSOH BioSciences | 19021 | We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column. | |
| PHOS-Select™ Iron Affinity Gel | Sigma-Aldrich | P9740 | This is the IMAC resin. Aliquot and store. |
References
- Albuquerque, C. P. A multidimensional chromatography technology for in-depth phosphoproteome analysis. Mol Cell Proteomics. 7 (7), 1389-1396 (2008).
- McNulty, D. E., Annan, R. S. Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phosphoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection. Mol Cell Proteomics. 7 (5), 971-980 (2008).
- Gygi, S. P. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotechnol. 17 (10), 994-999 (1999).
- Ross, P. L. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Gruhler, A. Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast pheromone signaling pathway. Mol Cell Proteomics. 4 (3), 310-327 (2005).
- Wilson-Grady, J. T., Villen, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of fission yeast. J Proteome Res. 7 (3), 1088-1097 (2008).
- Villen, J., Gygi, S. P. The SCX/IMAC enrichment approach for global phosphorylation analysis by mass spectrometry. Nat Protoc. 3 (10), 1630-1638 (2008).
- Jensen, S. S., Larsen, M. R. Evaluation of the impact of some experimental procedures on different phosphopeptide enrichment techniques. Rapid Commun Mass Spectrom. 21 (22), 3635-3645 (2007).
- Larsen, M. R. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Mol Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
- Pinkse, M. W. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Anal Chem. 76 (14), 3935-3943 (2004).
- Tao, W. A. Quantitative phosphoproteome analysis using a dendrimer conjugation chemistry and tandem mass spectrometry. Nat Methods. 2 (8), 591-598 (2005).
- Zhou, H., Watts, J. D., Aebersold, R. A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation. Nat Biotechnol. 19 (4), 375-378 (2001).
- Bodenmiller, B. Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome. Nat Methods. 4 (3), 231-237 (2007).
