Phosphoprotéomique quantitatives en acide gras Stimulé Saccharomyces cerevisiae</em
Summary
Description d'une procédure de phosphorylation quantitative à l'aide cryolysis, solubilziation urée, de fractionnement et l'enrichissement HILIC IMAC de peptides phosphorylés.
Abstract
Ce protocole décrit la croissance et la stimulation, avec l'oléate d'acides gras, des isotopes lourds et légers cellules de S. cerevisiae. Les cellules sont broyées à l'aide d'une procédure cryolysis dans un moulin broyeur à boulets et les grindate résultant mis en solution par solubilisation d'urée. Cette procédure permet la lyse des cellules dans un état métaboliquement inactives, la préservation de la phosphorylation et la prévention de la réorientation de l'phosphoprotéome lors de la lyse cellulaire. Après la réduction, l'alkylation, digestion par la trypsine des protéines, les échantillons sont dessalés sur des colonnes C18 et la complexité de l'échantillon réduit de fractionnement par chromatographie d'interaction hydrophile (HILIC). Colonnes HILIC retiennent préférentiellement des molécules hydrophiles qui est bien adapté pour phosphoprotéomique. Peptides phosphorylés ont tendance à éluer plus tard dans le profil chromatographique que leurs homologues non phosphorylées. Après fractionnement, phosphopeptides sont enrichis en utilisant la chromatographie en métal immobilisé, qui repose sur la charge basé sur des affinités pour l'enrichissement phosphopeptide. A la fin de cette procédure, les échantillons sont prêtes à être analysées quantitativement par spectrométrie de masse.
Protocol
Discussion
Cette méthode donnera un enrichissement de phosphopeptides qui peuvent être analysées quantitativement. Un certain nombre de paramètres peuvent être modifiés dans ce protocole, mais l'aspect le plus important à retenir est de préserver votre phosphorylation. Préparation des cellules pour la quantification peut être réalisé dans un certain nombre de manières différentes, par exemple, si vous ne pouvez pas l'étiquette de vos cellules in vivo, des étiquettes telles que l'ICAT [3] ou ITR…
Acknowledgements
Nous tenons à remercier le Dr Rich Rogers pour l'assistance technique avec des analyses par spectrométrie de masse et des discussions utiles, et les Drs. Rob-Moritz, Jeff Ranish, et Hamid Mirzai des discussions utiles.
Ce travail a été financé par le NIH Centres d'excellence.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4 | Sigma-Aldrich | 608033 | ||
| Isotec™ L-Lysine-15N2 | Sigma-Aldrich | 609021 | ||
| GIBCO™ Phosphate-Buffered Saline (PBS) 7.4 (10X) liquid | Invitrogen | 70011044 | ||
| SigmaFAST Protease Inhibitor Tablets | Sigma-Aldrich | S8820 | ||
| Pierce Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420 | ||
| Retsch PM100 Ball Mill Grinder | Retsch | 20.540.0001 | ||
| Retsch 125 ml Stainless Steel Grinding Jar | Retsch | 01.462.0148 | ||
| Ultramicrospin C18 column | The Nest Group | SUM SS10 | ||
| Sep-Pak Vac 500 mg C18 | Waters | WAT043395 | ||
| TSK-Gel Amide-80 4.6 mm x 25 cm analytical column | TOSOH BioSciences | 13071 | This is the HILIC chromatographic column. | |
| Guard column 4.6 mm ID x1 cm | TOSOH BioSciences | 19021 | We recommend this guard column to extend the life of your HILIC column. | |
| PHOS-Select™ Iron Affinity Gel | Sigma-Aldrich | P9740 | This is the IMAC resin. Aliquot and store. |
References
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