Phosphoprotéomique quantitatives en acide gras Stimulé Saccharomyces cerevisiae</em

Résumé

Description d'une procédure de phosphorylation quantitative à l'aide cryolysis, solubilziation urée, de fractionnement et l'enrichissement HILIC IMAC de peptides phosphorylés.

Résumé

Ce protocole décrit la croissance et la stimulation, avec l'oléate d'acides gras, des isotopes lourds et légers cellules de S. cerevisiae. Les cellules sont broyées à l'aide d'une procédure cryolysis dans un moulin broyeur à boulets et les grindate résultant mis en solution par solubilisation d'urée. Cette procédure permet la lyse des cellules dans un état métaboliquement inactives, la préservation de la phosphorylation et la prévention de la réorientation de l'phosphoprotéome lors de la lyse cellulaire. Après la réduction, l'alkylation, digestion par la trypsine des protéines, les échantillons sont dessalés sur des colonnes C18 et la complexité de l'échantillon réduit de fractionnement par chromatographie d'interaction hydrophile (HILIC). Colonnes HILIC retiennent préférentiellement des molécules hydrophiles qui est bien adapté pour phosphoprotéomique. Peptides phosphorylés ont tendance à éluer plus tard dans le profil chromatographique que leurs homologues non phosphorylées. Après fractionnement, phosphopeptides sont enrichis en utilisant la chromatographie en métal immobilisé, qui repose sur la charge basé sur des affinités pour l'enrichissement phosphopeptide. A la fin de cette procédure, les échantillons sont prêtes à être analysées quantitativement par spectrométrie de masse.

Protocole

La croissance cellulaire et les médias

1. Une seule colonie de cellules BY4742Δarg4Δlys1 nuit dans 100 ml rich media à une DO ₆₀₀ de 1,0, puis de graines en deux cultures de 1 litre d'un milieu de levure minime (0,17% de base azotée de levure sans sulfate d'ammonium ou des acides aminés, le sulfate d'ammonium 0,5%) contenant un gamme complète d'acides aminés, complétées par des 20mg / L de l'arginine isotopiquement normale ou lourde ⁽¹³ C ₆ ¹⁵ N _4; Isotec) et la lysine ⁽¹³ C ₆ ¹⁵ N _2; Isotec).
2. Les cellules ont été cultivées....

Discussion

Cette méthode donnera un enrichissement de phosphopeptides qui peuvent être analysées quantitativement. Un certain nombre de paramètres peuvent être modifiés dans ce protocole, mais l'aspect le plus important à retenir est de préserver votre phosphorylation. Préparation des cellules pour la quantification peut être réalisé dans un certain nombre de manières différentes, par exemple, si vous ne pouvez pas l'étiquette de vos cellules in vivo, des étiquettes telles que l'ICAT [3] ou ITRAC [4] peut être.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Isotec™ L-Arginine-13C6,15N4	Sigma-Aldrich	608033
Isotec™ L-Lysine-15N2	Sigma-Aldrich	609021
GIBCO™ Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 7,4 (10X) liquide	Invitrogen	70011044
Comprimés SigmaFAST d'inhibiteurs de protéase	Sigma-Aldrich	S8820
Cocktail d'inhibiteurs de phosphatase Pierce Halt	Thermo Fisher Scientific, Inc.	78420
Moulin à billes Retsch PM100	Retsch	20.540.0001
Jarre de broyage en acier inoxydable Retsch 125 ml	Retsch	01.462.0148
Colonne Ultramicrospin C18	The Nest Group	SUM SS10
Sep-Pak Vac 500 mg C18	Waters	WAT043395
Colonne analytique TSK-Gel Amide-80 4,6 mm x 25 cm	Tosoh Corp.	13071	Il s'agit de la colonne chromatographique HILIC.
Colonne de garde 4,6 mm de diamètre interne x 1 cm	Tosoh Corp.	19021	Nous recommandons cette colonne de garde pour prolonger la durée de vie de votre colonne HILIC.
Gel d'affinité au fer PHOS-Select™	Sigma-Aldrich	P9740	Il s'agit de la résine IMAC. Fractionner et conserver.