Un In vitro FluoroBlok Tumore Assay Invasion

Summary

Questo video dimostra come misurare l'invasione delle cellule attraverso inserti in coltura cellulare utilizzando una metodologia basata fluorescenza.

Abstract

La caratteristica delle cellule metastatiche è la loro capacità di invadere attraverso la membrana basale e migrare in altre parti del corpo. Le cellule devono essere in grado di secernere sia proteasi che degradano la membrana basale e migrare in modo da essere invasiva. BD sistema Tumore BioCoat Invasion fornisce cellule con le condizioni che permettono la valutazione della loro proprietà invasive<em> In vitro</em^1,2. Si compone di un Falcon BD FluoroBlok 24-pozzetti Inserire Piatto con una membrana di 8,0 micron, dimensioni dei pori di PET che è stato uniformemente rivestito con BD Matrigel Matrix. Questo strato uniforme di BD Matrigel Matrix funge da membrana basale ricostituita<em> In vitro</em> Fornire una vera e propria barriera per non invasiva cellule pur presentando una struttura adeguata di proteine ​​per lo studio invasione. Il processo di rivestimento occlude i pori della membrana, il blocco non invasiva cellule migrano attraverso la membrana. Al contrario, le cellule invasive sono in grado di staccarsi da e migrano attraverso la membrana rivestita. La quantificazione di invasione delle cellule può essere raggiunto da una pre-o post-invasione delle cellule di etichettatura con un colorante fluorescente come DiIC₁₂ (3) o calceina AM, rispettivamente, e misurando la fluorescenza delle cellule invasori. Poiché la membrana BD FluoroBlok blocca efficacemente il passaggio della luce 490-700 nm a efficienza> 99%, fluorescenza marcata cellule che non hanno invaso non vengono rilevati da un approccio bottom-lettura lettore di piastre in fluorescenza. Tuttavia, le cellule che hanno invaso la parte inferiore della membrana non sono più al riparo dalla sorgente di luce e vengono rilevati con il lettore di piastre rispettivi proprietari. Questo video mostra una cella di test endpoint invasione, utilizzando calceina AM per rilevare le cellule invase.

Protocol

Post-etichettatura e la misura utilizzando BD calceina AM colorante fluorescente Le cellule sono etichettati per la quantificazione dopo che hanno invaso attraverso il Matrigel BD Matrix e passato attraverso la membrana BD FluoroBlok. Di conseguenza, solo la misura finale di invasione delle cellule possono essere ottenute. Crescere le cellule a confluenza ~ 80%. Preparare e reidratare il sistema di inserimento. Rimuovere il pacchetto di stoccaggio da -20 ° C e permettono di venire a temperatura ambiente. Aprire la confezione ed aggiungere 500 microlitri caldo (37 ° C), mezzi di comunicazione verso l'interno dei pozzi inserto. Lasciare la piastra per reidratare per 2 ore a 37 ° C, 5% di CO 2. Nota: non è necessario reidratare il patinata BD Falcon FluoroBlok 24-pozzetti sistema Inserire che sarà utilizzato come controllo la migrazione delle cellule. Dopo la reidratazione, rimuovere con attenzione il supporto dai pozzetti inserire senza disturbare lo strato di BD Matrigel Matrix sulla membrana. Il sistema è ora pronto all'uso. Preparare sospensioni cellulari da trypsinizing monostrati cellulari e risospendere le cellule in DMEM senza siero a 5 x 10 4 cellule / ml. Nota: Se si utilizza un diverso tipo di cellule è necessario determinare la densità ottimale di semina. Per determinare la densità di semina ottimale per il vostro tipo di cellulare su una superficie porosa crescita, utilizzare una gamma di densità di semina (cellule / cm 2) che supporti la densità di semina utilizzati su superfici non porose (es. boccette, piatti e piatti). Per esempio, se attualmente seme a 2,5 x 10 5 cellule / cm 2, seme a concentrazioni di cellule diverse tra 5 x 10 4 e 5 x 10 5 cellule / cm 2 per determinare la densità ottimale di semina iniziale. Aggiungere 500 ml di sospensione cellulare (2,5 x 10 4 cellule) alle camere apicale. Aggiungere 750 ml di fattore chemiotattico (5% FBS in DMEM) per ciascuna camera basale, utilizzando le porte del campione per l'accesso. Incubare il sistema BioCoat BD tumore invasione e la non patinata BD Falcon FluoroBlok 24-pozzetti Plate per 20-22 ore a 37 ° C, 5% CO 2 nell'atmosfera. Dopo l'incubazione, rimuovere con attenzione di media dalle camere apicale. Questo può essere ottenuto sfogliando il contenuto in un contenitore per rifiuti. Non toccare la superficie inferiore del sistema di inserimento. Trasferire il sistema di inserire in un secondo 24 pozzetti contenente 500 microlitri / e di 4 mcg / mL calceina AM in HBSS. Incubare per 1 ora a 37 ° C, 5% di CO 2. La soluzione calceina AM non viene rimosso dalla camera bassa prima di leggere la fluorescenza, perché è un colorante nonfluorescent vitale che viene convertito in calceina verde fluorescente dalle esterasi del citosol. Fluorescenza delle cellule invase viene letto a lunghezze d'onda di 494/517 nm (Es / Em) su un fondo di lettura lettore di piastre a fluorescenza. L'impostazione di guadagno potrebbe essere necessario essere determinati empiricamente, ma un guadagno punto centrale dovrebbe essere un punto di partenza sufficiente. Un guadagno che è troppo alto può portare alla saturazione del rivelatore con il campione altamente fluorescenti, questo può impedire l'acquisizione di risultati significativi. L'uso di autogain (se supportato dal lettore) non è raccomandato. Un microscopio invertito a fluorescenza può essere usato per verificare i risultati, ma è particolarmente utile per fare questo la prima volta che si esegue questo test. Nota: E 'della massima importanza che i sistemi di inserti vengono letti utilizzando la mappa corretta piatto. Per informazioni sulle mappe di carico piatto vedere BD Bollettino tecnico n ° 436 il www.bdbiosciences.com o contattare il supporto tecnico BD (labware@bd.com). L'orientamento corretto piastra è ben A1 in alto a sinistra e il logo BD Flacone orientata a destra, come il piatto viene inserito nel lettore. Riduzione dei dati I dati vengono espressi come nella seguente equazione: Fondo possono essere sottratti prima del calcolo di invasione per cento delle cellule RFU = unità relative fluorescenti.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
BD BioCoat Tumor Invasion System		BD Biosciences	354165 or 354166
HT-1080 and NIH/3T3 cells		ATCC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM; serum-free)
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, without calcium and magnesium (DPBS)
BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert System to be used as a cell migration control		BD Biosciences	351157 or 351158
5% Fetal Bovine Serum in DMEM
BD Calcein AM Fluorescent Dye		BD Biosciences	354216 or 354217
Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS)
BD Falcon 24-well plates for post cell invasion labeling		BD Biosciences	351147
Fluorescence plate reader with bottom reading capabilities		PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.