Électrophorèse sur gel dénaturant Urée polyacrylamide (PAGE urée)

Résumé

Électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide urée est utilisée pour séparer l'ADN simple brin ou l'ARN jusqu'à une limite de 500 nucléotides. L'urée en combinaison avec des échantillons dénature la chaleur et non structurées brins simples migrer dans la matrice de gel en fonction de leur poids moléculaire.

Résumé

PAGE urée ou électrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide urée emploie 6-8 M d'urée, qui dénature l'ADN secondaire ou structures d'ARN et est utilisé pour leur séparation dans une matrice de gel de polyacrylamide en fonction du poids moléculaire. Fragments de 2 à 500 bases, avec des différences de longueur aussi petite que d'un seul nucléotide, peuvent être séparés en utilisant cette méthode ^1. La migration de l'échantillon est dépendante de la concentration d'acrylamide choisi. Un pourcentage plus élevé de polyacrylamide résout fragments de poids moléculaire plus faible. La combinaison de l'urée et des températures de 45-55 ° C pendant la course de gel permet la séparation de l'ADN non structurées ou des molécules d'ARN.

En général, cette méthode est nécessaire d'analyser ou de purifier l'ADN simple brin ou de fragments d'ARN, comme les oligonucléotides synthétisés ou étiquetés ou produits à partir des réactions de clivage enzymatique.

Dans cet article, vidéo, nous montre comment préparer et exécuter les gels de polyacrylamide dénaturant l'urée. Conseils techniques sont inclus, en plus des ^1,2 protocole original.

Protocole

Le protocole de texte complet et détaillé de cette procédure expérimentale est disponible dans Current Protocols in Molecular Biology. Détaillées étape par étape les instructions pour l'assemblage du sandwich de gel et pour les appareils de gel peut être trouvé sur le site BioRad ^3.

Équipement requis:
Les plaques de verre (intérieur et extérieur)
10 cm de cellules: 10,1 x 7,3 cm (plaque interne), 10,1 x 8,2 cm (plaque extérieure), BioRad
20 cellules cm: 20 x 20 cm (plaque interne), 20 x 22,3 cm (plaque extérieure), BioRad
De 0,5 à 1,5 mm de gel de peigne et entretoises
Se jetant Gel
....

Discussion

1. La netteté bande dépend de plusieurs facteurs. Le volume d'échantillon chargé pour les bandes pointus devrait être aussi petit que possible, c'est à dire idéalement entre 1-5 pl. Toutefois, jusqu'à 15 ul ne peut être chargé qui assure toujours une résolution acceptable. Moins de résultats volume d'échantillon plus nettes bandes.
2. La qualité bande est également dépendant de l'épaisseur du gel. Diluant gels, tels que 0,75 mm montrent de meilleurs résultats que 1,5 mm d'épaisseur des gels.
3. La for.......